蛋白水平的单个基因分析

蛋白特性分析

蛋白特性分析是指蛋白的一些物理和化学参数，如分子量、等电点、氨基酸和原子组成、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪族氨基酸指数、亲水性。这些参数，有助于进行蛋白的相关生化实验。比如在体外体系（大肠杆菌、酵母等）表达和纯化目的蛋白时，需要考虑蛋白的分子量、等电点、消光系数、不稳定系数和亲水性等。在酶活实验中，也需要根据这些参数优化实验体系。通过在线分析工具ProtParam（http://web./protparam/）对候选基因进行蛋白特性分析，分析结果如下图所示。

蛋白特性分析-ProtParam

蛋白亲疏水性分析

蛋白氨基酸的亲疏水性主要由其侧链基团R，如果R只是H或是C、H两元素组成的话，都是疏水的，如果含有极性侧链基团，如-OH、-SH、-COOH、-NH2等，则就是极性的（亲水的）。疏水性氨基酸有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和蛋氨酸（甲硫氨酸）。疏水性氨基酸在蛋白质内部，在保持蛋白质的三级结构上，酶和基质、抗体和抗原间的相互作用等各种非共价键的分子结合方面，具有重要作用。
在蛋白特性分析（ProtParam）结果中，已知蛋白的总平均亲水性（GRAVY）。GRAVY为正值且越大表示越疏水，负值越大表示越亲水，介于介于 0.5和-0.5之间的主要为两性氨基酸。通过在线分析工具Protscale（https://web./protscale/）可对蛋白亲疏水性进行进一步分析，如下图所示，从从整体来看，亲水氨基酸（负值）稍多于疏水的（正值），该蛋白表现为亲水性。且分析结果提供了蛋白质每个位置氨基酸的亲疏水信息，如676位的Ser丝氨酸分值最低（-3.167），亲水性最强；1047位的Trp色氨酸分值最高（3.344），疏水性最强。

蛋白亲疏水性分析-Protscale

跨膜结构分析

蛋白的跨膜结构分析对于预测蛋白的亚细胞定位密切相关。如果具有跨膜结构，蛋白很可能定位于细胞中与膜相关的结构，如细胞质膜、叶绿体膜或线粒体膜等内膜系统。此外，蛋白跨膜结构分析对于蛋白功能分析也有一定的帮助。比如某蛋白没有跨膜结构，但是亚细胞定位实验显示其可定位于膜相关结构，这说明该蛋白可能通过其他膜定位蛋白招募过去的。通过在线分析工具TMHMM（http://www.cbs./services/TMHMM/）对候选基因进行跨膜结构域分析。分析结果如下图所示，出现峰信号位置即为跨膜结构。

跨膜结构分析-TMHMM

信号肽分析

信号肽是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，常位于蛋白的N-末端，负责把蛋白质引导到不同膜结构的亚细胞器内。编码分泌蛋白的mRNA在翻译时首先合成N 末端的信号肽，它被信号肽识别蛋白(SRP)所识别，SRP将核糖体携带至内质网上，内质网膜上的SPR受体识别并与之结合。新合成蛋白在信号肽引导下到达内质网内腔，而信号肽则在信号肽酶的作用下被切除。由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。
在宿主菌中表达外源蛋白时，可用信号肽引导外源蛋白定位分泌到胞外，提高蛋白可溶性，在原核表达系统（大肠杆菌、芽孢杆菌等）和真核表达系统（如毕赤酵母）中均有应用。
通过在线分析工具SignalP（http://www.cbs./services/SignalP/）对候选基因进行信号肽分析，分析结果如下图所示，峰信号位置为信号肽切割点，峰之前的序列为信号肽。

信号肽分析-SignalP

磷酸化位点分析

蛋白质磷酸化指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，或者在信号作用下结合GTP（通常以GTP取代GDP），是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。在信号达到时通过获得一个或几个磷酸集团而被激活，而在信号减弱时能去除这些集团，从而失去活性。有时某个信号蛋白磷酸化通常造成下游的蛋白依次发生磷酸化，形成磷酸化级联反应。
磷酸化主要集中在酪氨酸（Tyr）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）残基上，这些残基上具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸化后蛋白质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化。
可通过NetPhos进行蛋白磷酸化位点预测。NetPhos是一种基于神经网络的方法（磷酸化位点周围氨基酸的重要意义），用于预测蛋白质序列中丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基的潜在磷酸化位点。输入FA格式的蛋白氨基酸序列，NetPhos 2.0（http://www.cbs./services/NetPhos-2.0/）版本可进行通用磷酸化位点预测，预测位点类型可选Tyr、Ser、Thr。分析结果包含三部分，输入序列名称和氨基酸序列以及预测磷酸化位点信息；每种氨基酸（Ser、Thr、Tyr）磷酸化位点详细信息；预测结果的图片展示。其中Pos表示分析的氨基酸位置（磷酸化位点），Context表示包含分析位点的9个氨基酸序列，Score为预测结果打分（0-1），Pred为对结果评估，打分高于0.5则为*S*、 *T*或 *Y*。

通用磷酸化位点预测- NetPhos 2.0

NetPhos 3.1（http://www.cbs./services/NetPhos/）可进行通用和激酶特异性磷酸化位点预测。激酶特异性磷酸化位点分析可预测以下17种激酶的位点：ATM，CKI，CKII，CaM-II，DNAPK，EGFR，GSK3， INSR，PKA， PKB，PKC，PKG，RSK，SRC，cdc2，cdk5和p38MAPK。分析结果中，#表示分析的氨基酸位置（磷酸化位点）；X为氨基酸（磷酸化）简写，Context为包含分析位点的9个氨基酸序列；Score为结果打分（0-1），一般高于0.5则为阳性结果；Kinase为激酶信息，unsp表示没有特异性激酶预测结果；Answer中Yes表示阳性结果，即打分高于0.5。

磷酸化位点预测- NetPhos 3.0

还可通过KinasePhos-2.0（http://kinasephos2.mbc./）对候选基因进行激酶特异性磷酸化位点预测。KinasePhos 2.0的磷酸化丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸的平均预测准确度分别为90％，93％，88％和93％。

磷酸化位点预测- KinasePhos-2.0

亚细胞定位预测

基因亚细胞定位是研究基因分子功能和生物学功能的基础。一个基因定位于哪个亚细胞结构，很大程度上与其功能是密切相关的。目前，可通过很多常规实验来研究基因亚细胞定位，如在原生质体或烟草中瞬时表达带荧光标签的目的蛋白，或者在转基因材料体内观察稳定表达的带荧光标签的目的蛋白信号。在进行实验之前，对基因的亚细胞定位进行预测，有助于实验的进行。通过在线分析工具PSORT Prediction（http://psort1./form.html）可对候选基因进行亚细胞定位预测分析。