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编译：Mr. Left，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名:Metabolomic and Transcriptomic Investigation of Metabolic Perturbations in Oryza sativa L. Triggered by Three Pesticides 译名: 三种农药触发的水稻代谢扰动的代谢组学和转录组学研究 期刊: Environmental Science & Technology IF: 6.667 发表时间：2020.3 通讯作者：朱利中 通讯作者单位：浙江大学 DOI号：https://dx./10.1021/acs.est.0c00425 实验设计 结果 MDA水平反映了氧化应激条件下细胞的损伤程度。如图S1所示，与未暴露对照叶片相比，标准使用浓度的三种农药均未显著影响水稻叶片MDA水平（p > 0.05）。而1.5倍和2倍浓度农药的暴露显著诱导了MDA含量的增加（p < 0.05），表明水稻叶片细胞受到了损害。此外，对DNA双链断裂高度敏感的生物标记物γ-H2AX的水平在任何农药测试浓度下都没有显著差异，这表明暴露在农药下的DNA没有受损。ROS水平是反映细胞损伤的另一个指标。作者发现，三种农药在规定的剂量暴露下对水稻叶片ROS水平无显著影响（p > 0.05）。但是，暴露于高水平的BUT和TRI会触发过量的ROS生成。通常，ROS水平的变化与抗氧化酶活性的变化有关，如SOD、CAT或POD，因为这些酶在氧化应激条件下可以清除和控制ROS水平。在本研究中，暴露于CPF后POD活性没有明显变化（p > 0.05），而暴露于2倍剂量的BUT和TRI后，POD活性分别升高至对照组的194.77和116.54%。此外，SOD活性随CPF暴露量的增加而显著增加，但随着BUT和TRI浓度的升高，SOD活性先升高后降低。CAT活性表现出与SOD活性相似的趋势，SOD和CAT活性下降表明当暴露于2倍剂量的BUT和TRI时，抗氧化酶不能有效清除ROS，而导致ROS过量积累。 此外，在暴露于所有三种农药之后，观察到了水稻叶细胞超微结构的变化。与对照相比，当暴露于规定剂量的CPF和BUT时，水稻叶绿体出现肿胀，淀粉颗粒占据了较大的叶绿体空间区域（图S2a2，b2）。由于淀粉颗粒的挤压，类囊体基粒减少，部分与间质类囊体的联系消失。这一发现与以往植物对低温、高盐度、干旱等非生物胁迫响应的研究结果一致。此外，暴露于2倍高剂量的CPF，会导致细胞形状不规则、叶绿体消失和淀粉颗粒崩解（图S2a3，b3）。叶绿体损伤会抑制能流和将可溶性糖转化为淀粉。因此，观察到的叶绿体变化表明在CPF和BUT胁迫下细胞内碳水化合物代谢可能受到抑制。有趣的是，TRI暴露引起油体（OB）积累，影响脂质储备和脂肪酸组成，可能表明存在密封应激响应。但是，用高浓度的TRI处理后发生的膜的破坏和OB的减少，表明脂质过氧化（图S2c2，c3）。 叶绿素荧光参数通常用作光合作用效率的指标。如图S3所示，当水稻植株暴露于CPF和TRI时，在处理组和对照组之间Fv/Fm均未观察到明显差异，表明光系统II（PSII）的光合作用效率对CPF和TRI胁迫均不敏感。然而，当水稻植株暴露于2倍剂量的BUT时，与对照相比，PSII活性（ΦII）显著提高了33.33％，而非光化学猝灭（NPQ）和NPQ系数（qN）与对照组相比，分别显著增加了26.89％和25.63％（p <0.05）。这表明，PSII光化学能量利用受到BUT暴露的抑制。这一发现还表明光合作用对除草剂高度敏感，这与之前报道的研究结果一致。 2 水稻对农药的代谢响应 非靶向代谢组学分析表明，基于鉴定的和量化的代谢物数据，水稻叶片中存在实质性的代谢变化。首先，使用无监督PCA分析来生成组间聚类信息的纵览。PCA得分图显示，未暴露对照组与BUT和TRI处理组沿第一主轴明显分离（PC1、68.1和63.8%）；与此同时，未暴露对照组与CPF处理组沿第二主轴有明显的分离（PC2，88.8%），说明三种农药均显著改变了暴露水稻叶片的代谢物组成。Venn分析进一步证实共有61种、79种和92种代谢产物分别对BUT、CPF和TRI响应（图S4，p < 0.05）。这些代谢物主要包括碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、核苷酸和次级代谢物（多元醇、糖苷、维生素）（p < 0.05，表S1-S3，支持信息）。其中，仅在BUT和TRI暴露组中检测到脂肪酸。此外，使用MetaboAnalyst 4.0软件整合了代谢组学数据以进行VIP和代谢通路分析（图S5）。富集分析表明，除草剂BUT显著影响了碳水化合物代谢中涉及的五个代谢途径，包括戊糖磷酸途径，糖酵解/糖异生，TCA循环，半乳糖代谢，淀粉和蔗糖代谢（38.5％，p <0.05，富集倍数> 2）。此外，杀虫剂CPF显著影响氨基酸代谢中涉及的六个代谢途径，包括精氨酸和脯氨酸代谢，β-丙氨酸代谢，谷氨酰胺代谢，酪氨酸代谢，天冬氨酸代谢，甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）代谢（60.0％，p <0.05，富集倍数> 2），而杀菌剂TRI显著影响了脂肪酸代谢所涉及的七个代谢途径，包括脂肪酸生物合成，脂肪酸代谢，脂肪酸延长，糖脂代谢，亚麻酸（ALA）和亚油酸代谢以及支链脂肪酸的氧化（53.9％，p <0.05，图1）。 图1 暴露于BUT（a），CPF（b）和TRI（c）的水稻叶片中代谢物变化的富集分析。结果来自使用MetaboAnalyst 4.0软件进行的分析。每个柱代表一个代谢途径，红色表示较高的影响，黄色表示较低的影响。p值<0.05和富集倍数> 2的途径被确定具有显著变化。 3 水稻对农药的转录组响应 为了更好地理解水稻植株对农药胁迫的代谢响应机制，使用基于RNA-Seq技术的转录组分析来鉴定水稻的基因表达。假发现率<0.05的基因被认为是差异表达基因(DEGs)。结果表明，三种农药对水稻叶片基因转录均有不同程度的影响，通过以红点和绿点为基础的火山图可视化了这些DEG的变化程度（图S6和S7）。 为了理解DEG的生物学意义，作者进行了GO和KEGG富集分析。如图S8和S9所示，在标准BUT剂量暴露下，许多DEG被分配给水稻叶片中的光合作用暗反应，而在2倍高剂量BUT暴露后，许多DEG被分配给碳水化合物的生物合成。这表明除草剂可能通过影响光合作用暗反应而影响碳水化合物的合成。在碳水化合物代谢中，除Os04g0664900（β-呋喃果糖苷转移酶，INV）和Os06g0676700（α-葡萄糖苷酶，MALZ）外，大多数酶的基因表达均下降，这与BUT暴露后淀粉和蔗糖浓度的变化一致（图S10）。此外，在暴露于标准剂量CPF的水稻叶片中，许多DEG被分配给氮代谢，而暴露于2倍高剂量CPF后，DEG被分配给氨基酸代谢（图S9a，b，表S5）。这表明杀虫剂CPF可能通过影响氮同化作用而影响氨基酸的生物合成。此外，在标准剂量TRI暴露下会显著影响一些参与脂肪酸伸长和α-亚麻酸代谢的DEG，而在2倍高剂量TRI暴露后，会显著影响参与糖鞘脂的DEG。有趣的是，在暴露于所有三种农药之后，叶片中的DEG被分配到了水稻中的丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号传导途径，表明水稻对农药的胁迫响应。 4 整合组学结果来揭示植物对农药响应的分子机制 4.1 碳水化合物代谢 在本研究中，主要碳水化合物，包括蔗糖、塔罗糖、木糖醇和果糖，都受到农药暴露的显著影响（图2a和S5）。尤其是在除草剂BUT暴露后，淀粉和蔗糖代谢，戊糖磷酸途径，糖酵解/糖异生和TCA循环显著富集于水稻叶片（图1）。在这里，淀粉和蔗糖代谢是主要的碳水化合物代谢，通过两种不同的途径发生在水稻叶片中。第一个途径涉及淀粉合成，其发生在叶绿体中。在此过程中，通过卡尔文循环产生的果糖-6-磷酸（果糖-6P）在ADP-葡糖焦磷酸化酶（GLGC）、淀粉分支酶（GBE）和颗粒结合淀粉合成酶（GLGA）的作用下，转化为葡萄糖-6-磷酸（葡萄糖-6P），再转化为淀粉。除草剂BUT暴露后，编码GLGC的基因（Os05g0580000）被上调。由于下游的蔗糖代谢升高促进了叶绿体中糖（例如葡萄糖-1-磷酸）的积累，因此GLGC基因上调将增加的葡萄糖-1-磷酸转移到ADP-葡萄糖中。然而，在规定浓度BUT暴露下，编码GBE（Os04g0409200）和GLGA（Os10g0437600）的基因被显著下调至对照的0.45倍和0.67倍；在规定浓度BUT暴露下，β-淀粉酶（Os10g0565200）的基因被显著下调至对照的0.31倍，即使在高浓度BUT暴露下也未检测到，这表明淀粉的分解比合成慢。因此，淀粉上游代谢物的增加和分解的降低促进了淀粉在叶绿体中的积累（图2b）。第二种途径发生在细胞质中，涉及蔗糖的合成和分解。这个过程将磷酸三糖从叶绿体运输到细胞质，在蔗糖合酶（SS）、INV和磷酸蔗糖合酶（SPS）的作用下转化为蔗糖(图2c)。在细胞质中，蔗糖可以被INV和MALZ进一步水解为单糖（如葡萄糖/UDP葡萄糖和果糖）。这一过程被认为是淀粉积累最有效的途径。根据本研究结果，INV、MALZ和SS基因的上调表达促进了蔗糖的分解，这与暴露于BUT条件下水稻叶片可溶性糖含量的变化一致（图S10）。已经证实通过合成蔗糖减少碳通量可能导致输出减少和叶片中淀粉积累增加。当碳水化合物的同化因环境胁迫而受损时，淀粉分解可以减少胁迫引起的碳消耗的不利影响。因此，淀粉的积累和分解是水稻对农药的有效胁迫响应。由于淀粉是水稻的主要营养物质，这种代谢产物的变化会影响水稻的健康和生理状态，最终影响水稻的产量和品质。 碳水化合物可通过糖酵解途径（EMP）和TCA循环被氧化。在非生物胁迫条件下，EMP通常可以改善植物对环境的适应性。通常，通过糖酵解途径将碳水化合物转化为丙酮酸需要多种酶的催化，其中磷酸果糖激酶（PFK），丙酮酸激酶（PK），丙酮酸脱氢酶（PDHB）和丙酮酸脱羧酶（PD）是最重要的酶（图2c）。在本研究中，发现暴露于BUT后EMP途径中PFK，PK，PDHB和PD基因的表达上调，从而提高了水稻对BUT暴露的耐受性（图2b）。EMP通路的增强可导致在非生物胁迫下产生更高的ATP。TCA循环是细胞能量产生的关键，它与生物合成途径协同作用以在胁迫条件下维持植物中的碳平衡。在本研究中，农药暴露胁迫增加了水稻叶片中重要TCA循环中间体的水平，如苹果酸（图2c和表S1）。这些中间体的变化受到异柠檬酸脱氢酶（IDH），琥珀酸脱氢酶（SDHB）和苹果酸脱氢酶（MDH）的调节，它们在异柠檬酸，琥珀酸，延胡索酸和苹果酸的合成和降解中起主要作用。其中，在2倍剂量BUT暴露后，编码IDH的基因Os04g0479200和Os01g0654500分别比对照水稻叶片的高1.80和1.77倍。编码MDH的基因Os12g0632700和Os08g0434300分别比对照高1.67倍和2.80倍。同时，编码SDHB的基因Os08g0120000比对照上调了1.70倍。这些结果表明TCA循环的增强（表S4）。以前也有类似的结果报道，暴露于除草剂咪唑乙烟酸后，水稻叶片中TCA循环所涉及的基因表达增加。这些结果表明，作物可以通过刺激三羧酸循环来抵御农药的胁迫。 图2 暴露于农药的水稻叶片中的碳水化合物代谢。叶片中碳水化合物的含量以从低（蓝色）到高（红色）的热图的形式显示，如色阶所示（a）。编码关键酶的基因包括GLGC、淀粉分支酶（GBE）、GLGA、SS、INV和MALZ（b）。其他酶及其基因表达见支持信息表S4。水稻叶片碳水化合物代谢示意图（c）。参与这些途径的酶被标记为红色。误差棒表示三个样本均值的标准差。*和**表示该值与对照相比有显著差异（p <0.05和p <0.01）。 4.2 氨基酸代谢 三种农药暴露后，水稻叶片中涉及氨基酸代谢的代谢物包括丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸显著积累（图3）。甘氨酸和丝氨酸是参与光呼吸过程的两种必需氨基酸；它们的积累表明，在农药胁迫下，水稻叶片的光呼吸过程增强。已经证实细胞碳代谢参与了光合作用和呼吸之间的平衡。光呼吸的增加可能导致净碳损失，这支持了以前报道的发现，即农药抑制了碳水化合物的代谢。此外，暴露于CPF和BUT会增加水稻叶片中总游离氨基酸的积累。特别是在高水平的CPF暴露后，总游离氨基酸比对照增加了29.02％。暴露于杀虫剂CPF中会显著干扰水稻叶片中的卟啉代谢，氨循环，氨基酸代谢和尿素循环。在这里，监测了天冬氨酸（Asp）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）和甘氨酸（Gly）作为CPF暴露的代谢标志物，其变化趋势与游离氨基酸的变化趋势相似（图3a和S10d）。Glu参与植物体内氮的同化和运输，在所有必需氨基酸和其他含氮化合物的生物合成中作为氮素供体。氮代谢依赖于三种关键酶，包括谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱羧酶(GAD)。在本研究中，这些酶的基因表达被上调（Os03g0223400、Os04g0543900、Os03g0720300、Os02g0650900），表明CPF胁迫增强了氮同化作用（图3b）。此外，Asp还被认为是蛋白质降解的瞬时标记物。在本研究中，CPF暴露后，水稻叶片中Asp含量上升，可溶性蛋白随之降解（与对照相比下降48.72%，图S10）。因此，农药暴露下观察到的氨基酸变化可能与增强的蛋白质降解有关。 图3 农药暴露对水稻叶片氨基酸代谢的影响。叶片中游离氨基酸的含量以从低（蓝色）到高（红色）的热图的形式显示，如色阶所示（a）。编码关键酶的基因包括GDH、GS、GAD、N-乙酰谷氨酸激酶2（argB）、天门冬酰胺合成酶（ASNS）和高丝氨酸脱氢酶（thrA）（b）。其他酶及其基因表达见支持信息表S5。水稻叶片中的氨基酸代谢示意图(c)。参与这些途径的酶被标记为红色。误差棒表示三个样本均值的标准差。*和**表示该值与对照相比有显著差异（p <0.05和p <0.01）。 4.3 脂肪酸代谢 脂肪酸是细胞膜的重要组成部分。本研究中，杀菌剂TRI显著影响了水稻叶片中饱和脂肪酸（SFA）和不饱和脂肪酸（USFA）的含量（图4）。USFA ALA（18:3）和十八烯二酸（OA，18:2）水平显著升高，呈剂量依赖性响应。此外，SFA软脂酸（PA，16:0）和硬脂酸（SA，18:0）水平显著降低（图4a）。这表明在TRI胁迫下细胞膜成分发生了改变。在这里发现ALA是响应TRI暴露的主要代谢标志物之一，有报道称ALA水平升高会导致MDA积累并导致膜损伤，这与本研究结果一致（图S1和S2）。一般来说，脂肪酸的合成和降解受一系列酶的调控。本研究结果显示，关键酶的基因，包括3-酮酯酰辅酶a合成酶（KCS，Os05g0574600），酰基载体蛋白去饱和酶（SAD，Os01g0118300）和长链酰基辅酶a合成酶（LACs，Os05g0132100），在TRI暴露胁迫下被显著上调（图4b）。其中，KCS和LAC通过激活SFA介导脂肪酸链的延长。这两种酶的基因表达上调，表明超长链脂肪酸（VLCFAs）的合成增加和SFA含量降低。此外，SAD是脱氢酶，在脂质分子中将SFA转化为USFA时起着关键作用。SAD基因的表达上调可以促进USFA的合成，这与观察到的ALA和OA水平的变化一致。此外，与脂质降解有关的关键酶的基因，包括α-甾体脱氢酶（SRD），α-双加氧酶（α-DOX1），油体钙蛋白相关蛋白（Cals）和α-固醇去甲基酶（CYP51），均被TRI胁迫显著上调。有趣的是，所有这些酶都位于OB膜中（图4c）。众所周知，OB是储存中性脂质的细胞内细胞器，如甘油三酯和固醇酯，被嵌入在磷脂单分子层中的一些蛋白所包围，如油体膜蛋白，油体钙蛋白和油体固醇蛋白。在这些蛋白质中，油体钙蛋白参与了OB降解的调节。在本研究中，Cals基因（Os02g0734400）在TRI暴露胁迫下上调，这与脂质浓度（甘油和2-棕榈酸甘油酯）的减少以及游离脂肪酸浓度的增加是一致的。此外，油体固醇蛋白是另一种丰富的OB蛋白，可能与OB的形成或降解有关。本研究表明，编码SRD（Os07g0162100）和CYP51（Os05g0211100）的基因在TRI胁迫下分别上调2.21倍和4.42倍，这与甾醇贮藏(菜油甾醇和豆甾醇)含量的下降一致（文本S3）。此外，高水平的TRI可使脂肪酸代谢酶促蛋白α-DOX1的基因表达上调25.34倍，表明脂肪酸的代谢功能得到了增强，从而导致了游离脂肪酸在水稻叶片中的积累。 图4 农药暴露对水稻叶片脂肪酸代谢的影响。TRI暴露后水稻叶片中关键脂肪酸含量的变化（a）。编码关键酶的基因，包括KCS，SAD，LAC，SRD，α-DOX1，Cals和CYP51。其他关键基因表达见支持信息表S6。编码这些酶的基因表达请见（b）。脂肪酸代谢的代谢物和基因表达水平的变化显示于（c）。脂肪酸含量的误差棒（a）代表八个样品平均值的SD。基因表达的误差棒（b）代表三个样品平均值的SD。*和**表示该值与对照相比有显著差异（p <0.05和p <0.01）。 4.4 MAPK信号级联 讨论 对环境的意义 更多推荐 1 高分综述 | Trends in Biotechnology: 单细胞分辨率下利用空间转录组揭示器官分子结构（国人佳作） 2 重磅综述 | Cell：非编码RNAs在肿瘤学中的作用（IF=36.216）
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