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北京大学基础医学院病原生物学系暨感染病中心 HBV感染可引起慢性乙型肝炎（CHB）、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌等终末期肝病，严重威胁着人类健康。HBV 感染呈世界性流行，全球约有 2.4 亿慢性HBV感染者。在我国，预防性乙型肝炎疫苗的广泛接种使新发感染率明显下降，然而我国仍然是 HBV 感染的中高流行区。据推算，2016 年我国一般人群HBsAg阳性率为6.1%（95%可信区间:5.5%~6.9%），HBsAg阳性人群约 8600.7 万。 HBV 属于嗜肝DNA病毒科，其通过HBsAg的 pre-S1 区与肝细胞膜上的受体-钠离子/牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）结合进入肝细胞。随后，核衣壳在细胞质内裂解并将部分双链的松散环状 DNA（rcDNA）释放入细胞核内，并通过宿主DNA聚合酶和拓扑酶等修补DNA 双链缺口，形成共价闭合环状DNA（cccDNA）。随后，以 cccDNA 为模板，分别转录出 3.5 kb 的前基因组 RNA（pgRNA）和preC mRNA，以及 2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb 的 mRNA，转录本在细胞质内翻译形成相应蛋白。翻译形成的P蛋白与 pgRNA 结合后招募core蛋白，并组装成病毒核衣壳。pgRNA在核衣壳内逆转录形成HBV DNA负链，再以负链为模板合成HBV DNA正链，形成病毒核心颗粒。最终，病毒核心颗粒经多囊泡小体包膜化并以病毒颗粒形式释放至细胞外。此外，合成的含有rcDNA的病毒核心颗粒也可进入细胞核补充 cccDNA 池，使得HBV cccDNA 在肝细胞核内维持 5~50 拷贝/细胞。虽然 CHB 患者中 cccDNA 通常只占肝内 HBV DNA 总量的很少一部分，但其半衰期长，可稳定存在于肝细胞核内，是 HBV 持续感染难以清除的重要原因。 目前临床上治疗CHB的抗病毒药物为核苷（酸）类药物（NAs） 和IFN。NAs 主要通过抑制P蛋白的逆转录活性，并与内源性核苷竞争性掺入病毒的 DNA 链，终止 DNA 链的延长和合成，从而抑制病毒的复制。NAs 可有效抑制病毒复制并延缓疾病进程，但由于其不直接作用于cccDNA，停药后易复发，需要长期用药，进而存在依从性、耐药，以及经济和心理压力等一系列问题。IFN 具有免疫调节作用和抑制病毒基因转录的双重作用，但由于其存在一定的副作用，疗程有限，仍难以彻底清除HBV。由此可见，目前的抗病毒治疗很难实现CHB的临床治愈。究其原因，cccDNA的持续存在是CHB患者接受抗病毒治疗后难以实现临床治愈的重要因素。因此，研发靶向HBV cccDNA的药物至关重要。本文将针对靶向HBV cccDNA的药物和生物技术的研究进展作一综述。 1 靶向cccDNA的基因编辑技术 目前，靶向cccDNA的常用基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关（Cas）蛋白9 （CRISPR/Cas9）技术。 1.1 靶向cccDNA的ZFN技术 2010年，Cradick等首次证实ZFN可靶向切割HBV DNA基因组，使HBV pgRNA水平降低29％。2014年，Weber等针对HBV基因组P、C和X区开放阅读框设计了3个ZFN，并利用腺相关病毒载体递呈HBV特异性ZFN，测试其在HepAD38细胞中的抗HBV活性。结果表明，ZFN通过诱导靶位点碱基突变有效地破坏HBV基因组，其中腺相关病毒递送的靶向P区开放阅读框的ZFN可高效抑制HepAD38细胞中HBV复制，并持续至少2周。上述通过ZFN技术靶向破坏HBV基因组的研究证实了将基因编辑技术应用于抗病毒治疗的可能性。 1.2 靶向cccDNA的TALEN技术 Bloom等设计了针对HBV基因组的TALEN，并证实TALEN可诱导cccDNA靶位点发生突变，首次证明了TALEN技术通过破坏HBV cccDNA有效抑制HBV复制。2014年，该团队进一步将TALEN与DNA同源重组技术相结合，其首先通过靶向HBV基因组的TALEN切割HBV DNA，随后，将人工设计的靶向HBV的初级microRNA(pri-miR)序列作为供体序列，通过DNA同源重组整合至病毒基因组中。一方面，该pri-miR序列能在病毒启动子的作用下转录形成靶向HBV的miRNA从而抑制病毒复制，另一方面，由于插入pri-miR序列导致的错义突变将进一步破坏病毒基因，进而协同抑制HBV复制。TALEN技术的应用为基因编辑技术通过靶向破坏HBV cccDNA抑制病毒复制提供了新的思路。 1.3 靶向cccDNA的CRISPR技术 CRISPR/Cas9系统通过单链导向RNA（gRNA）和Cas9蛋白指导基因编辑。与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系统设计及操作更为简单，这使其得到了广泛的应用。2014年，Lin等设计了8条靶向HBV的gRNA，并证实通过CRISPR/Cas9系统可靶向切割HBV基因组，并显著抑制HBV复制。Wang等发现与单个gRNA相比，双gRNA介导的CRISPR/Cas9系统可通过去除切割位点之间的片段来更大程度地破坏HBV基因组，从而更为高效地抑制HBV复制。2017年，Wang等进一步通过gRNA-miR-HBV-gRNA 三联表达框架将CRISPR/Cas9和RNAi技术整合，借助miRNA 在细胞内的加工过程最终产生两个靶向HBV的 gRNA和一个靶向HBV的miRNA（miR-HBV），二者协同降低细胞内 cccDNA 水平，促进HBV清除。除了直接靶向cccDNA外，由于cccDNA的形成需要宿主因素的参与，还可通过靶向宿主基因从而影响cccDNA的合成。最近的一项研究报道，聚合酶κ是在新发HBV感染期间cccDNA形成所需的关键宿主因子。使用CRISPR/Cas9系统敲减HepG2-NTCP细胞中聚合酶κ基因表达可显著抑制rcDNA向cccDNA转化，降低cccDNA水平。随着CRISPR技术的发展和对HBV复制周期认识的加深，具有更高编辑效率和更低脱靶率的CRISPR系统也有望用于抗病毒研究与治疗中。除了上述3种常见的基因编辑工具外，另有报道称在体外使用靶向HBV cccDNA的ARC核酸酶可显著破坏cccDNA和整合到人体肝细胞中的HBV DNA。 （详细内容请参考网址http:///gilead-sciences-and-precision-biosciences-announce-collaboration-to-develop-therapies-against-hepatitis-b-virus-using-arcus-genome-editing/） 然而，目前基因编辑技术潜在的脱靶效应以及缺乏合适的体内递呈载体限制了其在临床上的使用，通过基因编辑技术靶向cccDNA仍有待进一步开发与优化。 2 表观遗传学修饰靶向静默cccDNA 表观遗传学修饰，即DNA甲基化和组蛋白修饰等。多项研究已证实表观遗传学修饰可调控HBV cccDNA转录，进而影响HBV复制。 2.1 靶向 cccDNA的DNA甲基化修饰 HBV基因组包含3个主要的CpG岛，并且cccDNA的微染色体结构受DNA甲基化的表观遗传学调控。Zhang等分析了cccDNA中CpG岛甲基化的分布，并研究了CpG岛甲基化对病毒复制的影响，结果表明CpG岛Ⅱ的甲基化可显著降低cccDNA的转录水平，提示改变HBV cccDNA的甲基化状态可作为一种潜在的实现功能性治愈的手段。 2.2 靶向cccDNA的组蛋白修饰 2006年，Pollicino等发现与cccDNA结合的H3/H4组蛋白乙酰化状态可调节HBV复制。组蛋白去乙酰化酶1可募集到cccDNA上导致组蛋白去乙酰化，并抑制HBV复制。I类组蛋白去乙酰化酶抑制剂可上调H4组蛋白乙酰化，并促进HBV复制。Liu等发现IFNα可通过降低H3组蛋白赖氨酸(H3K）9和H3K27的乙酰化水平抑制cccDNA转录。Zhang等发现蛋白质精氨酸甲基转移酶5可通过促进cccDNA上H4组蛋白精氨酸3的对称二甲基化抑制HBV core蛋白和基于Brg1的人SWI/SNF染色质重塑体的相互作用，进而抑制RNA聚合酶Ⅱ与cccDNA的结合。由此可见，通过调节cccDNA结合组蛋白乙酰化酶或去乙酰化酶的活性，可作为抗HBV治疗的靶点。 以上多项研究证实表观遗传学修饰对 HBV 的持续存在和清除起着重要作用，表明表观遗传治疗具有治疗CHB的潜力。此外，可以通过借鉴肿瘤和其他病毒性疾病的表观遗传治疗，为CHB的治疗开辟新途径。 3 细胞因子靶向清除cccDNA 除了治疗性疫苗之外，许多细胞因子可参与HBV感染的控制。Lucifora等发现高剂量IFNα处理能刺激APOBEC3A的表达，淋巴毒素β受体激活能刺激APOBEC3B的表达，二者可通过HBV core蛋白与cccDNA相互作用，导致胞苷脱氨基，脱嘌呤/脱嘧啶位点形成，从而导致cccDNA降解。Xia等发现IFNγ和TNFα能各自诱导cccDNA脱氨基并干扰其稳定性，并证实HBV特异性T淋巴细胞不需要细胞溶解所需的直接接触，而是通过分泌IFNγ和TNFα亦可抑制HBV复制并降低感染细胞中cccDNA水平。Bockmann等研究发现IFNβ和IFNλ能使肝细胞中HBV cccDNA通过脱氨基作用发生G-A序列改变。并且与IFNα相比，IFNβ和IFNλ诱导的APOBEC脱氨酶表达更为持久。Qiao等在后续的研究中发现TGFβ可通过肝细胞中激活诱导的胞苷脱氨酶诱导cccDNA脱氨基降解和突变。然而，有关细胞因子针对HBV cccDNA的抗病毒作用还有待进一步的研究。 4 靶向病毒蛋白负性调控cccDNA 病毒蛋白包括HBV X蛋白（HBx）和core蛋白在cccDNA的转录过程和维持cccDNA的稳定性中都发挥着重要作用。因此，除了直接靶向HBV cccDNA外，通过靶向这些病毒蛋白也能实现对cccDNA的调控。 4.1 靶向HBx抑制cccDNA 转录 HBx能通过与宿主的损伤特异性DNA结合蛋白1（DDB1）结合从促进HBV复制。Decorsière等发现HBx通过降解染色体结构维持（Smc）复合物Smc5/6可缓解Smc5/6对HBV cccDNA转录的抑制作用。Murphy等进一步证明HBx与DDB1-CUL4-ROC1（CRL4）E3连接酶相互作用，泛素化降解Smc5/6，进而促进HBV复制。基于此，Sekiba等发现一种噻唑化物抗感染剂硝唑尼特可有效抑制HBx-DDB1蛋白的相互作用，并在人原代肝细胞中证实硝唑尼特能够恢复Smc5蛋白水平，进而抑制HBV cccDNA转录和病毒蛋白产生。 4.2 靶向core蛋白干扰cccDNA合成 NAs虽然并不直接作用于cccDNA，但却通过抑制以前基因组RNA为模板逆转录合成rcDNA的过程，阻断cccDNA的补充，因而被认为具有间接耗竭cccDNA的作用。然而，现有NAs并不能够完全阻断新rcDNA的合成。核衣壳装配调节剂（CpAM）能变构调节core蛋白结构并随后改变core蛋白组装的动力学和途径，导致形成不规则形状的core蛋白聚集体或缺乏pgRNA和P蛋白的空衣壳。除了抑制核衣壳组装和随后的病毒基因组复制之外，CpAM还能改变核衣壳的结构和功能，并因此影响病毒DNA复制和（或）cccDNA补充。CpAM能诱导病毒粒子以及含有双链DNA的核心颗粒发生解体，从而在新发感染和细胞内扩增过程中干扰cccDNA生物合成途径。了解core蛋白质变构调节剂对核衣壳装配和拆卸的双重作用所依据的分子机制将有助于发现新的靶向core蛋白的抗病毒药物，进而更加有效地抑制cccDNA合成和治疗CHB。CpAM作为一种针对新靶点的抗病毒药物，未来有望联合其他抗病毒药物共同清除HBV。 总之，现阶段有多个靶向 HBV 生命周期各个阶段的新型抗病毒药物正在研发之中，其中靶向HBV cccDNA的治疗策略被认为是最有可能清除 HBV 的手段，故被认为是HBV 新药发展的重要方向。此外，结合免疫治疗的多途径、多靶点药物联合阻断 HBV 的生物学合成并促进cccDNA清除将可能成为根治慢性 HBV 感染的重要途径。但目前对 cccDNA 形成、维持及降解的生物学机制尚未完全阐明，相关基础研究亟需加强。 引证本文：CHEN R, WANG J, LU FM. Advances in drugs and biotechnology targeting hepatitis B virus cccDNA[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(6): 1188-1191. （in Chinese) 陈然, 王杰, 鲁凤民. 靶向HBV cccDNA的药物及生物技术[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(6): 1188-1191. |
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