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复旦大学附属华山医院 HBV感染是一个严重的公共卫生问题，全球约有24亿人感染HBV，我国目前大约有8600万慢性HBV感染者。HBV一般认为是通过内吞作用进入人体肝细胞，然后将病毒基因组转运到细胞核中，经由多个尚未明确的加工过程，在细胞核中双链均未共价连接的松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA) 形成了双链共价连接的共价闭合环状DNA(cccDNA)。HBV cccDNA是编码所有 HBV RNA的唯一模板，它对病毒复制的起始和维持是必需的，是导致病毒持续感染和复发的主要原因，从慢性HBV感染的肝细胞中清除HBV cccDNA被认为是实现根除HBV持续感染的关键。在抗病毒治疗之前、期间和之后监测HBV cccDNA对于慢性乙型肝炎患者的疗效评估极为重要。此外,随着靶向HBV cccDNA的抗HBV新药研发的不断推进，也迫切需要准确而灵敏的HBV cccDNA检测方法，以评价其疗效。Southern印迹方法被认为是HBV cccDNA检测的经典的方法。与常用的PCR方法相比, Southern印迹方法极为复杂, 成本高，且耗时，不适合临床应用。近20年来国内外已经报道了一些HBV cccDNA的检测方法，包括选择性PCR、竞争性PCR、Invader法、原位杂交等，但在敏感度和特异度方面仍存在一定的不足。近年来，又陆续发展了一些新的HBV cccDNA检测方法，如引入酶切的实时定量PCR(qPCR)法、磁珠捕获杂交法、滚环扩增结合原位杂交法、数字PCR法和单细胞内HBV cccDNA检测等方法，本文就这些最新的方法学进展作简要的介绍。 1 引入酶切的qPCR检测HBV cccDNA qPCR检测HBV cccDNA的基本原理就是设计HBV cccDNA特异性引物跨越HBV病毒基因组中的缺口区域以避免直接扩增rcDNA等，但是它们在选择性扩增HBV cccDNA上并不是绝对的，其原因是线性单链由于引物延伸形成的产物在短重叠区域内自退火，由此产生的PCR产物用于进一步指数扩增的线性模板与 HBV cccDNA衍生产物无法进行区分。与非选择性引物不同，HBV cccDNA引物在优化的PCR程序中确实显示出一定的特异性，但是当与rcDNA共存时，这不能保证扩增HBV cccDNA绝对的特异性。 为了提高检测特异度，2004年前后，一些研究者如Zoulim团队开始使用不降解质粒的ATP依赖DNA酶（PsD）来处理样本。PsD是一种最初用于从质粒制备物中去除细菌染色体DNA的酶，优先水解双链线性DNA，它对线性和闭环单链DNA具有较低效率，对HBV cccDNA和带切口的环状双链DNA也没有活性。尽管如此，有研究者称PsD可使rcDNA等其他形式的HBV DNA降低一个数量级，而可保持HBV cccDNA的含量不变。一些学者对酶切方法处理用于HBV cccDNA检测的标本提出质疑，主要考虑到增加酶切步骤，可能使标本稀释，同时酶切反应液中的成分也可能抑制PCR反应，会增加假阴性结果。 直到2010年，Nassal等研究表明PsD不能消化rcDNA，Southern印迹表明PsD消化鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染的肝细胞中提取的总DNA，并没有导致完整rcDNA去除。这可能是由于增加了染色体DNA作为PsD的竞争底物的竞争；此外PsD水解短双链线性DNA效果较差，这意味着当样本中存在的总基因组DNA时，PsD的作用受到限制。 2017年Hu课题组发现了3’端核酸外切酶Exonuclease(Exo) Ⅰ和Exo Ⅲ可用于降解所有含开放3’端的DNA而保留双链的闭合环状DNA。本课题组也建立了一种HBV cccDNA定量检测方法, 并通过AD38细胞系、动物模型和肝组织等样本证实了Exo Ⅰ & Ⅲ降解消化作用，结果表明这种核酸酶的处理方法能够降解HBV cccDNA以外的HBV DNA，此法改进并提升了HBV cccDNA 检测的敏感度和特异度。 2018年Stephan团队证实qPCR选择性引物的胞浆显示信号要比其他非特异性引物的扩增信号低36.8倍。通过胞浆DNA和细胞核DNA的扩增比较，没有HBV cccDNA引物显示出绝对的特异度。随后作者使用来自体外感染的细胞将T5 Exo、Exo Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ & Ⅲ和PsD处理后直接进行了比较，并进行Southern印迹和qPCR。结果显示：T5 Exo和Exo Ⅲ去除胞质HBV DNA复制中间体的效果基本相似。通过实时PCR同时定量样本显示出Exo Ⅲ去除了98％，T5 Exo去除97％和Exo Ⅰ&Ⅲ去除99％的总HBV DNA。相比之下Exo Ⅰ和PsD效率较低，只是Exo Ⅰ略有增强了Exo Ⅲ的活动。该文有力支持T5 Exo或Exo Ⅲ纯化HBV cccDNA有较好的效果。 2 磁珠捕获杂交法检测HBV cccDNA 因为HBV cccDNA存在含量低和结构复杂等特性，HBV cccDNA的选择性分离和富集是必需的。磁性颗粒已被广泛应用于从复杂混合物中分离核酸。核酸的选择性提取对于从样本中分离靶DNA或RNA是必不可少的。该方法通常使用用链霉抗生物素蛋白或短寡核苷酸功能化的磁性颗粒。磁珠表面可以通过生物结合技术以各种方式进行修饰，并且杂交效率与溶液中的相似，优于使用其他固定固体支持物的杂交效率。2015年，磁性纳米粒子首次被引入对特定的HBV cccDNA捕获，用这种方法捕获的HBV cccDNA通过变性释放并进一步用于传统的qPCR。使用反向微乳液法合成磁珠，然后用链霉抗生物素蛋白(SA)修饰。通过SA修饰二氧化硅包覆的纳米颗粒制备功能化纳米颗粒，并将颗粒与生物素标记的探针偶联，以利用SA与生物素的极高亲和力相互作用。设计靶向rcDNA缺口两侧的选择性探针并用其标记生物素在5’末端。功能化的纳米颗粒与荧光标记的寡核苷酸靶标杂交，磁性纳米颗粒-SA-生物素-HBV cccDNA探针复合物经过优化，并证明可与HBV cccDNA特异性杂交。在样品溶液中的HBV cccDNA与复合物杂交后，洗去上清液，并加入qPCR组分。通过高温变性将HBV cccDNA与复合物分离，然后进行常规PCR定量。通过磁捕获杂交富集HBV cccDNA，减少了HBV cccDNA富集对rcDNA的干扰，从而提高了qPCR检测HBV cccDNA的特异度。该方法捕获探针的长度可能影响相同杂交区间中HBV cccDNA捕获的效率，它也不能捕获所有HBV cccDNA分子，但检测浓度和预期浓度之间的差异在可接受的范围内，此外该方法所需的材料特殊，成本比qPCR更高。 3 滚环扩增（RCA）结合原位PCR（IS-PCR）法 2008年，Margeridon等首先应用RCA定性探测HBV cccDNA。Zhong等将RCA与实时PCR结合起来提高了检测HBV cccDNA的灵敏度。用Phi29 DNA聚合酶设计4对引物用于RCA，然后RCA产品作为进一步实时PCR的模板。RCA的引入大大提高了HBV cccDNA检测的灵敏度和特异度，并最大限度地降低了整合HBV DNA的干扰，这在经典qPCR中被忽略了。到目前为止，大多数HBV cccDNA定量方法还未能揭示HBV cccDNA在肝组织中的分布和定位。为了解决这个问题，2014年Zhong等进一步将RCA和IS-PCR结合组合在FFPE肝组织中检测HBV cccDNA。将组织切成切片，切片用HE染色、脱蜡、蛋白酶K和PSAD消化。在RCA之前进行。在RCA处理后，将在5’-末端用地高辛标记的HBV cccDNA选择性引物和其他PCR组分加入组织载玻片中，将载玻片密封，包封并放入热循环仪中进行PCR。在IS-PCR后立即将载玻片固定、渗透、封闭、与抗地高辛碱性磷酸酶缀合的抗体一起温育并显现。最后，将载玻片复染并安装用于显微镜检查。尽管原位PCR可能导致扩增的DNA扩散到邻近的细胞，交联的组蛋白或其他HBV cccDNA结合蛋白，每种细胞可以很容易地检测到两个拷贝的HBV cccDNA。但是该方法比较复杂费时。 4 数字PCR检测HBV cccDNA 微滴数字PCR(ddPCR)是一种新的不依赖于外部校准曲线的高敏感和特异度的分子检测方法。ddPCR技术是基于PCR值和泊松统计有限稀释，稀释后，PCR混合物被分成更小部分，每个反应都经过独立测试以评估单分子中靶核酸的数量，靶核酸的绝对数量在原始样本中可以通过泊松计算阳性率与总分区的比率统计。通过微滴化技术来实现数字PCR，本质上数字PCR采用终点检测的方法实现对核酸分子(DNA与RNA)数目的绝对定量。2015年Mu等研究结果表明，应用ddPCR结合PsD酶预处理和特异性引物能够精确检测HBV cccDNA的单拷贝，使其成为目前已经报道 HBV cccDNA检测中的最灵敏和准确的方法。但是，当模板数量大于106个拷贝时，实际值偏离理论值。因为在较高的目标浓度下由于正液滴饱和引起ddPCR显示相对较窄动态范围，形成泊松算法无效。尽管如此，HBV cccDNA在患者体内一直处于相对较低水平，因此绝大多数患者和研究样本属于ddPCR可检测的范围，相比qPCR提供的结果，ddPCR可以获得更高的灵敏度。与能够检测超过108的qPCR系统相比，ddPCR能够不依赖标准曲线检测极低浓度的HBV cccDNA模板，在精确定量样品非常低的拷贝数时是非常有用工具。这个属性特别适用于在抗病毒治疗期间定量监测肝脏活组织中HBV cccDNA波动的水平。2018年，意大利研究者Caviglia等使用ddPCR检测隐蔽感染患者HBV cccDNA水平，研究发现50%左右的受试者存在隐蔽感染；隐蔽感染者中又有50%左右的患者通过ddPCR检测出了HBV cccDNA。选择性ddPCR在检测HBV cccDNA的灵敏度和精密度方面优于普通qPCR，尤其是低水平病毒载量检测方面。ddPR与qPCR系统相比，尽管两者使用相同的引物和探针，但ddPCR是精确定量更有价值的工具，检测极低浓度的能力和高重复性是ddPCR独有的优势。 5 单细胞的HBV cccDNA检测 当今一场新兴的研究正在生物学界兴起，一系列研究单细胞生物学的成果不断涌现，它们正在促使科学家以创新的视角重新审视一些传统的研究领域。当生物研究真正的问题取决于于单细胞的功能时，对大量细胞进行总体分析是很难奏效的。我们知道异质性是细胞的天然特性之一，那些看似相同的一群细胞，其内部有可能存在千差万别。HBV cccDNA检测过去主要集中在肝内细胞总的HBV cccDNA上，基本没有考虑肝内单细胞的HBV cccDNA。2018年刘松梅等建立的HBV cccDNA选择性微滴式数字PCR（ddPCR）方法用于单细胞等的检测，该研究分离单个HepG2.15细胞的方法是：细胞在用磷酸盐缓冲液洗涤后，将105个细胞/ml重悬于磷酸盐缓冲盐水中，然后在Transferman NK2显微操作器上使用10 μm转移器获取单细胞。该研究并没有研究临床样本的单细胞HBV cccDNA。单细胞分析已经渐渐渗透生物医学的相关领域，随着相关技术的不断进步，它将继续推动基础和临床研究协同发展。从某种意义上说，在未来人类的健康将很大程度上取决与我们对于自身细胞的深度了解，因为，细胞是构成生命基本单元，一切问题的根本都将归结于细胞本身。 6 总结与展望 大量研究表明，HBV cccDNA是慢性乙型肝炎持续感染的元凶，作为病毒转录的模板，HBV cccDNA在宿主肝细胞内以微染色体的形式存在。由于HBV cccDNA在患者肝脏中的水平极低，传统的分子生物学方法很难检测。目前，针对HBV cccDNA检测的新方法有qPCR、磁珠杂交捕获法、RCA结合IS-PCR和数字PCR等。qPCR包括数字PCR等主要借助和引物跨缺口设计和酶处理来特异性检测HBV cccDNA；磁珠杂交捕获主要优势是特异性提取捕获HBV cccDNA；RCA结合IS-PCR提高了检测HBV cccDNA的特异度；单细胞的HBV cccDNA研究还在起步阶段。随着精准医学的到来，将可能有更多的方法应用于HBV cccDNA的检测，准确而灵敏的HBV cccDNA检测方法对乙型肝炎的预测和早期诊断，靶向治疗以及治疗效果的评估有重要的临床意义。 引证本文：JIANG PX, MAO RC, ZHANG JM. Recent advances of quantitative detection methods for HBV covalently closed circular DNA[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(6): 1201-1204. （in Chinese) 江培学, 毛日成, 张继明. HBV cccDNA定量检测方法的研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(6): 1201-1204. |
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