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“健康衰老”近年逐渐成为大众和科研工作者关注和研究的热点，衰老及相关疾病已成为困扰人民和国家社会保障的一大难题。据国家统计局数据，2018年，我国65岁及以上人口比重已达11.9%，人口老龄化程度持续加剧。这大大增加了劳动年龄人口的压力，同时也给我国社会保障、经济发展带来了巨大的挑战。细胞是机体组织器官最基本的单元，因此想要解决健康衰老的难题，我们首先要探究细胞内部的染色质、线粒体、各种大分子以及代谢等在衰老过程中会有怎样的变化，以及我们该如何鉴别他们的变化。对于以上的问题，来自不同学科的研究者们有着不同的理解，同时由于实验条件等方面的不同，研究者们对于衰老细胞的评价也存在着差异。这严重阻碍了衰老领域的研究。因此，学者们急需对细胞衰老的特征与生物标志物达成共识。2019年10月31日，来自美国、法国、英国、德国、以色列等国家的衰老研究者们所成立的“国际细胞衰老学会”（International Cell Senescence Association, ICSA）就细胞衰老的特征与生物标志物达成共识。Vassilis Gorgoulis教授等作为共同通讯作者在Cell上发表题为“Cellular Senescence: Defining a Path Forward”的文章，介绍了共识的内容，主要包括细胞衰老的定义、特征、现阶段的检测技术及面临的挑战等。 Vassilis Gorgoulis教授 
细胞衰老（Cellular senescence）是一种细胞状态，与多种生理过程及衰老相关疾病密切相关。近年来，人们对以细胞衰老为靶点来改善健康、治疗衰老相关疾病（即衰老细胞清除疗法）越来越感兴趣，而准确清除衰老细胞是这一疗法的关键点。在此，我们与国际细胞衰老协会（the International Cell Senescence, ICSA）提出一个共识，定义并讨论了衰老过程中的关键细胞及分子特征，同时还给出了如何使用这些生物标记物的建议。此外，我们开发了一个资源工具-SeneQuest （http://Senequest.net），以帮助确定衰老相关基因，也提出了一种可以在培养的细胞及体内准确评估和量化衰老的算法。生理或应激信号刺激细胞，改变细胞状态，并最终影响组织稳态及个体健康。然而，生理和应激信号导致的结果是不同的，受信号特征（类型、大小和持续时间）、时空和细胞应答能力等因素影响。细胞在受到潜在损伤压力时，损伤可被修复，细胞能够恢复结构和功能的完整性。但当损伤不可逆转时，细胞就会激活死亡机制以减弱对组织的损伤。除此之外，当细胞面临不可逆转的损伤时，也可以转化为另一种有利于生存的状态，但通常会伴随着永久性的结构和功能的改变。例如，细胞可以转变为衰老状态（细胞保持活性但不增殖)，细胞衰老状态不同于细胞G0期静息状态及终末分化状态。“细胞衰老”一词来源于拉丁语 “senex”，意为”年老的“，并在1961年由Hayflick及其同事首次正式描述。细胞衰老这一现象最初是在有限次分裂（Hayflick limit）后停止增殖的正常二倍体细胞中观察到的。后来，研究者们证实这种现象是由端粒缩短造成的（详见“细胞周期停滞”章节）。
细胞衰老被认为是对多种压力信号的反应，包括：暴露于遗传毒性剂、营养缺乏、缺氧、线粒体功能障碍及原癌基因激活等（表1）。在过去十年间，不断改进的实验工具及小鼠模型的建立都大大扩宽了我们对衰老细胞起因及表型的认识。然而，目前业界关于衰老细胞的组成及典型标志还没有达成共识。此外，尽管细胞衰老与个体衰老密切相关，但是个体衰老（aging）与细胞衰老（senescence）的意义是不同的。在个体发育的各个阶段都存在大量诱导衰老信号（包括不依赖于端粒缩短的信号），因此，细胞衰老贯穿整个生命周期，包括胚胎发生期（细胞衰老发挥着促进组织发育的作用）及成年期（细胞衰老在此阶段发挥着阻止损伤细胞扩增，促进组织修复及增强肿瘤抑制的作用）。因此，细胞衰老可能是进化中多种因素相互拮抗的一个例子，也可能是一种既具有有益影响，又具有有害影响的细胞程序。在此，我们阐述了细胞衰老的几个特性，包括（1）细胞衰老的关键特征、（2）衰老的综合定义、（3）鉴定衰老细胞的方法、（4）衰老细胞在生理和病理过程中的作用，为开发新的治疗策略奠定基础。
表1.引发衰老的因素 细胞衰老是一种由压力信号刺激产生，存在于特定生理过程的细胞状态，具有典型的细胞周期停滞、衰老相关分泌表型、大分子损伤及代谢紊乱特征（表1）。这些特征相互联系（图1）。下面将分别详细描述这些特征。
图 1. 细胞衰老标志表型。衰老细胞表现出以下四个相互关联的特征：（1）细胞周期停滞；（2）大分子损伤；（3）衰老相关分泌表型（SASP）；（4）代谢紊乱（详见正文）。 衰老细胞的一个共同特征是不可逆转的细胞周期停滞，可能是由有害刺激或异常增殖引起的警报反应。这种细胞周期停滞与细胞静息状态和终末分化均不同。细胞静息状态是一个暂时的停滞状态，当合适的刺激存在时，细胞会重新进入增值状态。终末分化是细胞为获得特定的功能所进入的状态，并伴随着持久的细胞周期停滞，但其介导途径与细胞衰老途径不同（图2）。与之相反，衰老细胞会获得一种新的表型，虽然衰老细胞周期停滞通常是不可逆转的，但在某些特殊情况下，特别是在肿瘤细胞中，细胞可以重新进入细胞周期（图2）。在哺乳动物细胞中，视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma, RB）家族和p53蛋白对于衰老细胞周期停滞至关重要。RB1和其家族成员p107（RBL1）、p130（RBL2）可以被特定的细胞周期素依赖性激酶（Cyclin-Dependent Kinases, CDKs: CDK4, CDK6, CDK2）磷酸化。其磷酸化可以减弱RB家族抑制E2F家族转录激活因子的活性。然而，在衰老细胞中，CDK2的抑制因子p21 WAF/Cip1（CDKN1A）和CDK4/6的抑制因子p16INK4A（CDKN2A）会发生积累。这种积累促使RB家族蛋白持续活化，抑制E2F的反式激活，从而导致无法逆转的细胞周期停滞，即使RB家族蛋白或p53随后被失活，这种细胞周期停滞也很难得到逆转。细胞周期停滞的持久性是通过E2F（转录因子，调控细胞周期蛋白E和A）靶基因的异染色质化、衰老细胞分泌的细胞因子及持续性的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)产生实现的。值得注意的是，在衰老的小鼠细胞中，p16INK4A基因位点的另一种阅读框蛋白ARF (Alternate Reading Frame)也在调节细胞周期停滞中起着重要作用。衰老细胞周期停滞的其他特征包括核糖体生物发生缺陷和反转录转座子的去抑制。然而，准确的细胞周期停滞相关标记还没有发现。例如，RB和p53的蛋白激活也发生在其它形式的细胞周期停滞中。即使是相对特异的衰老相关标记—p16INK4A也会在特定的非衰老细胞中表达，且并不是在所有衰老细胞中都表达。因此，检测衰老相关的细胞周期停滞需要量化多种因素和特征。
图 2. 衰老细胞、静息状态细胞和终末分化细胞的细胞周期停滞。图中显示了细胞周期停滞在可逆性、激活信号（见正文）、分泌功能和大分子损伤等方面的差异，这些差异可用来区分这些细胞状态。大分子损伤是衰老的共同特征，而分泌则是衰老所共有的另一个的特征，有时（环境依赖性）也在分化状态有发现。细胞周期停滞被认为在衰老和终末分化的过程中是不可逆的，但细胞在某些条件下也会重新进入细胞周期。绿色字体：激活和/或存在，红色字体：抑制和/或不存在。箭头表示细胞状态之间的联系。 衰老细胞会分泌大量的因子，包括促炎细胞因子和趋化因子、生长调节剂、血管生成因子和基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs），统称为衰老相关分泌表型（Senescent Associated Secretory Phenotype, SASP）或衰老信息分泌组（Senescence Messaging Secretome, SMS）（图1；表2）。SASP是衰老细胞的标志之一，它介导了许多衰老细胞的病理生理效应。例如，SASP可以以自分泌和旁分泌的方式增强和传播衰老，激活免疫系统清除衰老细胞。SASP因子可以参与细胞衰老，伤口愈合，组织可塑性过程，同时也会造成持续的慢性炎症（即“发炎”）。因此，SASP对于细胞会产生有害的、促衰老的作用。此外，SASP可以招募未成熟的免疫抑制性髓样细胞到前列腺和肝脏肿瘤中，并通过驱动血管生成刺激肿瘤的发生和转移。衰老细胞周期停滞受p53和p16INK4A/RB抑癌途径调控，而SASP则受增强子重塑和转录因子激活的调控，如NF-κB、C/EBPβ、GATA4、雷帕霉素哺乳动物靶点（Mammalian target of rapamycin, mTOR）和p38-MAPK信号途径。不同的衰老诱导因子可以通过多种上游信号通路激活SASP，包括DNA损伤、激活1型干扰素应答的细胞质染色质片段（Cytoplasmic Chromatin Fragments, CCFs）、激活炎性小体的损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs）。根据衰老持续时间、促衰老刺激源和细胞类型的不同，SASP的组成和程度也会有很大差异。此外，单细胞RNA测序表明不同细胞间SASP的表达量也有明显异质性。例如，从早期转化生长因子β（TGF-β）依赖性分泌蛋白到促炎分泌蛋白的转变受Notch1活性的控制。此外，作为较为晚期SASP的事件，1型干扰素反应在一定程度上是由于LINE-1逆转录转座元件的去抑制所致。衰老细胞也可以通过旁分泌NOTCH/JAG1信号通路、活性氧（ROS）释放、细胞质桥和胞外囊泡（如外泌体），与微环境进行交流。总的来说，在每个生物背景下定义衰老分泌组将有助于确定衰老相关分子特征。细胞衰老所体现出的第一个分子表征是端粒的缩短，主导原因为DNA末端复制出现“障碍”。端粒是在染色体末端的末端环中发现的，由端粒蛋白复合体稳定的重复DNA结构。这种结构使得端粒无法被DNA损伤应答（DNA Damage Response, DDR）和双链DNA断裂（Double-Strand DNA break, DSB）修复途径识别。端粒酶能够维持端粒的长度，在大多数正常的体细胞（非干细胞）中并没有表达，而大多数已经越过衰老这一进程的癌细胞中却有表达。此外，正常细胞端粒酶活性的重新激活能够延长端粒长度并增强其在培养中的传代能力。端粒长度会随着细胞增殖逐渐缩短，导致端粒DNA环的结构稳定性丧失以致端粒结构破坏，端粒功能障碍致病灶（Telomere Dysfunction-Induced Foci, TIFs），激活DNA损伤应答，最终阻滞细胞周期，同时也可以通过抑制或突变参与端粒维持的基因达到一样的结果。端粒相关病灶（Telomere-Associated Foci, TAFs）是另一种形式的DNA损伤，由端粒G端重复序列的DNA氧化损伤导致，且其在端粒中的发生不因端粒长度或染色体丢失的情况而改变。尽管衰老细胞中近一半DNA的持续损伤都集中在端粒上，其他亚细胞毒性带来的损伤压力也可以通过诱导不可修复的DNA损伤来导致细胞衰老（图1）。许多基因毒性物质，包括辐射（电离和紫外线）、药物因子（如某些化疗药物）和氧化应激均可导致细胞衰老。此外，致癌基因的激活可作为一种肿瘤抑制反应导致细胞衰老，称为癌基因诱导的细胞衰老（即Oncogenes Induced Senescence, OIS），从而抑制潜在癌变细胞的失控增殖。OIS通常由CDKN2A位点编码的肿瘤抑制因子p16INK4A和ARF介导，使细胞周期强制终止。然而，DDR在触发OIS方面也发挥了重要作用，这种情况的机理为：致癌基因驱动的过度增殖，使得损坏的复制叉出现损伤信号。最近的研究表明，在OIS过程中，DDR和ARF通路可以协同作用，且前者比后者需要的致癌负荷更低。衰老细胞有持续存在的核DNA损伤灶，称为DNA-SCARSs（DNA segments with chromatin alterations reinforcing senescence）。DNA-SCARSs与瞬时损伤灶不同的是，它们与早幼粒细胞白血病（Promyelocytic Leukemian, PML）的核体特异相关，缺乏DNA修复蛋白RPA和RAD51以及单链DNA （ssDNA），并含有活化的形式CHK2和p53（调控DDR）。DNA-SCARSs是一种动态结构，可能调控衰老细胞包括生长停滞和衰老相关分泌表型等多个方面。然而，并不是所有细胞衰老引发的刺激都会产生持续的DNA损伤应答，DNA-SCARSs并不是衰老细胞所共有的特征。CCFs是衰老细胞中另一种类型的DNA损伤。这些CCFs激活了由cGAS-cGAMP-STING通路介导的促炎症反应，可以作为另一个非广谱性的衰老相关标记物。蛋白毒性是个体衰老和细胞衰老的标志。因此，蛋白质损伤有助于识别衰老细胞（图1）。ROS是蛋白质损伤的一个重要来源，它能氧化蛋氨酸和半胱氨酸残基，改变蛋白质的折叠和功能。许多蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs）的活性部位存在的半胱氨酸残基都能够被氧化失活。这种失活可以通过激活ERK信号导致细胞衰老，这和激活的致癌基因的效果是类似的。在肿瘤前病变中检测到了高水平的磷酸化的ERK（p-ERK），而在衰老细胞（如黑色素细胞痣和良性前列腺增生（Benign Prostatic Hyperplasia, BPH）等）中，p-ERK大量富集，这也是诱导性衰老的特征。识别氧化半胱氨酸的单克隆抗体可以作为PTP氧化模式的标记物。ROS在金属离子存在时可以羰基化脯氨酸，苏氨酸，赖氨酸和精氨酸残基。蛋白质羰基化使得疏水层暴露在外，导致蛋白质结构的展开以及聚集。蛋白质羰基化残基可以利用抗体特异性检测。此外，羰基化残基可以与氨基反应形成希夫氏碱（Schiff bases）促进蛋白质的聚集，随后与糖和脂类交联形成不溶性多聚体，称为脂褐素，源自希腊语“lipo”，意为“脂肪”，“fuscus”意为“黑色的”。脂褐素可使用生物素苏丹黑B（Sudan Black B, SBB）模拟物（GL13）（在体内外衰老细胞的另一种指标），可以通过光学显微镜或组织化学方法在溶酶体中观察到。需要注意的是，即使细胞分裂停止，损伤的积累也会继续并持续数月甚至数年。大多数蛋白质的氧化损伤是不可逆的，泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin Proteasome System, UPS）或自噬降解往往会消除这些蛋白质。由于UPS和自噬在衰老细胞中的呈现激活状态，因此它们可以作为细胞衰老状态的表征之一。同样，PML体作为ROS和氧化损伤的传感器，也可以作为细胞衰老的非广谱性的生物标志物。
表2 衰老相关分泌表型成分 脂质对于细胞膜的完整性、能量的产生和信号转导都是必不可少的。一些与衰老相关疾病会影响脂质代谢，导致脂质结构的改变。虽然衰老细胞以脂质代谢变化为标志，但尚不清楚这一过程是如何产生衰老表型的（图1）。在衰老过程中，线粒体功能紊乱可能导致ROS驱动的脂质损伤、脂质沉积以及和脂褐质的积累。除了氧化作用外，在衰老细胞中也有脂质衍生的醛类修饰（如4-羟基-2-壬烯醛[4-HNE]）的相关报道。衰老细胞中的脂质沉积可以用各种商业化的染料和检测手段进行检测，也可以使用免疫染色法观察脂质相关蛋白（如perilipin 2）鉴定。值得注意的是，对肥胖和衰老小鼠衰老细胞的基因编辑或药物清除可以减少脂质在肝脏和大脑中的沉积。尽管细胞衰老与脂质积累密切相关，但我们对其中特定脂质代谢物成分的知之甚少。脂肪酸及其前体和磷脂分解代谢物（如二十碳五烯酸酯（Eicosapentaenoate,EPA）、丙二酸酯、7-羟基-3-氧基-4-胆甾烯酸酯（7- HOCA）以及1-硬脂酰甘油磷酸肌醇）在衰老的成纤维细胞中有所增加，而亚油酸酯、二同型亚油酸酯和10-十七烯酸酯则相对减少。此外，还伴随有游离胆固醇的增多，源自醋酸酯中的磷脂和胆固醇酯的减少以及脂肪酸合酶和硬脂酰CoA去饱和酶-1含量的下降。尽管目前已经有一些检测组织和细胞中脂质变化的方法，然而由于衰老相关脂质谱的高度变异性，这些指标作为衰老生物标志物的应用十分受限。（例如，脂质代谢产物在致癌基因诱导的衰老和复制性衰老之间就存在显著差异。）衰老细胞在线粒体功能、动力学和形态上表现出多种改变。衰老细胞中的线粒体功能减弱，表现为膜电位降低、质子泄漏增加、融合和分裂率降低、质量增加和三羧酸（Tricarboxylic Acid, TCA）循环代谢物种类增加。虽然衰老细胞中线粒体的数量可能逐渐增加，但它们产生ATP的能力似乎受到了损害。相比之下，虽然衰老细胞线粒体的呼吸功能受到损伤，但是其会产生更多能引起蛋白质和脂质损伤的ROS（参见“蛋白质损伤”和“脂质损伤”），同时ROS还会导致端粒的缩短以及DDR的活化。在线粒体生物学方面，如电子传递链（Electron Transport Chain, ETC）、复合物I组装、线粒体裂变率、生物发生、线粒体去乙酰化和/或TCA周期的中断都可以导致衰老。衰老过程中AMP : ATP和ADP : ATP比值的改变通过激活AMPK（AMP-激活蛋白激酶，可以感应能量损失），而导致细胞周期停滞。衰老过程中的线粒体功能障碍也与SASP调控有关。衰老细胞中的线粒体自噬（线粒体清除）可能对SASP也存在抑制作用。即使在缺乏关键促炎SASP因子（如IL-6和IL-8）表达的细胞中，对ETC的遗传或药理抑制仍可诱导细胞衰老。。NAD+/NADH比值在衰老细胞中降低，这会使聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly-ADP Ribose Polymerase, PARP）和sirtuins的活性发生改变，这两者都参与了SASP调控因子NF-κB的激活。虽然大量的数据支持在体外培养的细胞中，线粒体功能的变化在衰老方面发挥着重要作用，但在体内是否一致尚不清楚。虽然线粒体功能障碍和氧化应激的小鼠模型出现了衰老进程加深的表型，但线粒体在体内的衰老细胞中的功能还没有进行过详细的描述。因为线粒体功能障碍同时也存在于其他细胞过程，它并非仅属于细胞衰老的特异性标记。最后，在衰老和与衰老相关疾病中，衰老细胞是否导致线粒体功能受损尚不清楚。分泌需要同时激活合成和分解代谢过程（见“分泌表型”章节）。溶酶体趋向于分解代谢过程，因为这一过程水平的提高会提供能量和原料，溶酶体是吞噬作用、内吞作用和自噬进行降解的最终地点。溶酶体的生物发生是受转录驱动并取决于细胞的能量或降解需求。有趣的是，当溶酶体腔内氨基酸水平较高时会引发mTOR1的募集和激活，反之亦然。此外，溶酶体与线粒体相互作用能保持线粒体内环境的稳定（见“线粒体”章节）。衰老细胞中的溶酶体数量和大小均有增加，通过显微镜可以看到明显的胞质颗粒。逐渐增多累积的功能失调的溶酶体可能会试图使细胞通过产生更多的新溶酶体来平衡。因此，合成和分解代谢之间的平衡，对分泌至关重要。致癌基因诱导的细胞衰老过程里，这种平衡在TOR自噬空间耦联间隔（TOR-Autophagy Spatial-Coupling Compartment, TASCC，高尔基体反侧的一个细胞间隔，能够协调SASP因子的产生）中得到维持。溶酶体内容物的增加并不一定等同于其活性增加，因为溶酶体的内容物在自噬的降解阶段也是减少的。因此，溶酶体-线粒体轴降解，导致线粒体更新减少，从而增加ROS的产生。随后，ROS作用于包括溶酶体在内的各细胞结构，形成一个恶性循环，产生更多的损伤。溶酶体质量的增加与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性（衰老生物标志物）有关。然而，尽管SA-β-gal在衰老细胞中显著存在，但它既不是衰老表型的必需因素，也不是衰老表型的决定因素。从治疗的角度来看，溶酶体室的扩大提供了一个更大的能力来捕获可质子化的药物，比如CDK4/6抑制剂帕博西尼（palbociclib）、瑞博西尼（ribociclib）和玻玛西尼（abemaciclib）。这种能力虽然降低了这些药物在胞浆和细胞核中的有效浓度，但由于溶酶体中药物会缓慢释放，药物暴露时间反而有所延长。另一个与溶酶体功能异常相关的衰老特征是脂褐素聚合体在溶酶体内的富集（见“蛋白损伤”和“脂质损伤”章节）。有趣的是，脂褐素被报道可刺激抗凋亡因子BCL-2的表达，使细胞具备凋亡抗性，这是衰老细胞的另一个特征。衰老细胞中的溶酶体也参与细胞染色质片段加工（CCFs）。（见“DNA损伤”与“分泌表型”章节）上述特征与基因表达的变化息息相关，由编码和非编码RNA的转录调控决定，可用于细胞衰老的检测。在这里，我们关注这些在细胞衰老进程中影响显著的基因表达的变化，并介绍一个可以帮助辨别与衰老相关的基因的新数据库，名为“SeneQuest”。尽管表观遗传修饰发生在细胞衰老过程中，但其主要还是依赖于环境因素。例如，复制性衰老一直与CpG位点的DNA甲基化完全丧失有关。此外，细胞衰老还会导致某些CpG岛DNA甲基化的局部增加。有趣的是，这种DNA甲基化谱在某种程度上与癌症和个体衰老相关的甲基化模式类似，而经历了OIS的细胞没有表现出这种DNA甲基化的改变，以上现象均增加了衰老过程中表观遗传的多样性。衰老细胞在整体上也表现出染色质开放性增加，但全基因组图谱因微环境中刺激的不同也会发生变化。个体组蛋白修饰和变异在衰老过程中会发生改变。例如，H4K16ac在细胞衰老过程中经常在活性启动子处富集，但在增殖过程中则并非如此。它的积累与组蛋白变异体H3.3密切相关，组蛋白变异体H3.3通过HIRA/UBN1/CABIN1和ASF1a分子伴侣以独立于DNA复制的方式沉积到染色质中。值得注意的是，H3.3的N端蛋白裂解与细胞衰老过程中不同基因亚群的基因抑制相关。连接蛋白H1的整体缺失是另一个细胞衰老的特征。某些组蛋白修饰在衰老进程中发挥了重要的作用，如H4K20me3和H3K9me3的上调会阻遏增殖，而基因增强子区域H3K27ac水平的上调则促进SASP的发生。衰老也与染色质形态变化有关。衰老相关的异染色质病灶（Senescence-Associated Heterochromatin Foci, SAHFs，通过DAPI染料染色密集区域能够可视化）富含异染色质蛋白（HP）1。SAHFs来源于染色质因子（包括RB、组蛋白变异体macroH2A、高迁移率A族蛋白、HIRA/UBN1/CABIN1和ASF1a分子伴侣）并会增加核孔密度。人们最初认为SAHFs会参与基因调控。然而，随后的研究表明SAHFs中大部分是晚期复制的基因，即使在增殖细胞中也是如此，这表明SAHFs在衰老相关基因表达中发挥的作用很小。衰老也与连接组蛋白H1的整体丢失有关。值得注意的是，由于SAHFs并不存在于所有衰老细胞中，因此它们似乎是细胞类型和刺激依赖性的。也因此，SAHFs可有助于细胞衰老的鉴定，而其功能意义尚待阐明。另一个染色质特征（称为衰老相关卫星膨胀（Senescence-Associated Distension Of Satellites, SADSs））体现为着丝粒及其周围异染色质的致密度降低。SADSs先于SAHFs的形成，可能与细胞衰老密切相关。转座子是另一种与衰老有关的构成性异染色质。通常被处于的LINE-1（L1）的逆转录转座子被激活，刺激cGAS-STING通路，引起Ⅰ型干扰素反应（见“分泌表型”章节）。因此，除了导致基因组不稳定性外，这些元素还会刺激SASP产生。核纤层的主要成分层核纤层蛋白B1的下调是细胞衰老的另一个重要特征。核纤层蛋白B1的丢失与表观遗传学特征以及与衰老相关的染色质结构（SAHFs和SADSs）有关。它的减少主要发生在富含H3K9me3的区域，这一过程会将H3K9me3从核膜上释放出来，促进H3K9me3异染色质的空间重排形成SAHFs。OIS的Hi-C分析（染色质构象的全基因组图谱分析技术）显示H3K9me3和核纤层蛋白B1富集区域的局部连接性降低，干扰了这些长距离的相互作用。另一方面，复制性衰老表现为染色体内长距离相互作用的丧失和近程相互作用的增加，这意味着衰老相关的高秩序性的染色质相互作用是依赖于外界刺激和环境的。此外，核纤层蛋白B1的丢失和核完整性的降低可能通过促进CCF的形成来促进SASP产生，从而刺激cGAS-STING途径和干扰素反应（见“分泌表型”章节）。自噬介导的CCF形成和组蛋白合成减少也可能导致核心组蛋白在衰老过程中的全部丢失，影响染色质形态。衰老表型与衰老类型的验证常使用细胞周期停滞相关及SASP相关的几个基因，并结合其他生物标志物（图1）。例如，细胞周期蛋白依赖的激酶的抑制物CDKN1A （p21WAF1/Cip1）, CDKN2A （p16INK4A）, CDK2B （p15INK4B） 和部分SASP基因表达量的增加，以及细胞周期蛋白CCNA2, CCNE2和LMNB1表达量的下降。此外，应当建立假定衰老细胞的转录组，然后将其与不断增加的现有衰老转录组进行比较。全转录组学已经被作为工具应用于主要信号通路研究，涉及衰老表型的建立， 特定条件下药物靶点的预测。例如，近年的一项研究中，在癌基因诱导，复制诱导或DNA损伤诱导三种不同条件分别诱导的不同类型衰老细胞中，相同的13个基因受到差异调控。最近，一项只涉及成纤维细胞和上皮细胞的相似研究，也试图定义衰老相关的转录组特征。虽然当前缺乏衰老相关转录组数据集，但许多单细胞研究（可用于评估人群内部差异）正在进行。因此，几年内这些衰老相关基因特征可能将会发生改变。但是，最终在多种条件的体外培养下及体内的实验中，将会证明衰老基因表达的特征对于鉴定衰老是有价值的。非编码RNA，特别是miRNA（microRNA, miRNA），可以单独或协同影响细胞衰老进程。miRNA功能研究揭示了几个miRNA直接或间接调控关键衰老效应因子p53, p21WAF1/Cip1和SIRT1的丰度。miR-504靶向p53的3’UTR, 降低p53丰度与活性。同样地，Gld2介导miR-122的稳定，使其能够结合CBEP 3’UTR, 从而导致p53 mRNA聚腺苷酸化和转录降低。相反地，miR-605靶向的MDM2启动p53介导的衰老，并且多个miRNA下调p21WAF1/Cip1，包括阻断OIS的28个miRNA。同样，miR-24在细胞和骨关节炎疾病模型中抑制p16INK4A。复杂的miRNA反馈环路可以调节衰老进程。例如，p53/miRNA/CCNA2通路独立于p53/p21WAF1/Cip1调控衰老。相似地，p53依赖性的上调miR34a/b/c可以下调细胞增殖与存活因子。非编码RNA也能调控SASP。例如，在诱导衰老后的数周，miR-146a/b增加并抑制SASP促进炎症的通路。miRNA也可以下调衰老的抑制因子，包括多梳蛋白（Polycomb Group, PcG）家族成员CBX7, EED, EZH2和SUZ12 （miR-26b, 181a, 210和424），导致p16INK4A的抑制解除，促进衰老。最后，miRNA在衰老中的作用超出了其经典功能。例如，在细胞核中Argonaute 2 （AGO2）结合let-7f，再与RB1形成一个复合物pRB，导致CDC2和CDCA8启动子上的染色质抑制。这些E2F靶基因的沉默是启动衰老所必要的。长链非编码RNA （Long non-coding RNAs, lncRNAs）能够结合RNA，DNA或蛋白质来调控衰老。例如，ANRIL是一个长30-40kb由CDKN2A位点编码的反转录产物，其可以结合CBX7抑制INK4B/ARF/INK4A的表达。同样地，lncRNA PANDA通过招募PcG复合物抑制衰老启动基因。然而，p53响应lncRNA GUARDIN的沉默则会造成细胞衰老或细胞凋亡。相比之下，在RAF诱导OIS之后，lncRNA VAD通过减少抑制性的H2A.Z在INK启动子上的积累来维持衰老。同样，lncRNA UCA1干扰RNA结合蛋白hnRNP A1与p16INK4A的结合，但不会干扰与p14ARF的结合及其转录。另外，以miRNA为重点的非编码RNA分析提出了一个衰老特征。有趣的是，衰老细胞释放的小胞外囊泡中miRNA含量随着时间的推移而变化。衰老蛋白标记物的研究始于OIS。除了已知的细胞周期调控蛋白外，一些研究还发现DCR2也是衰老的一个常见标志物，后来证明它标记了另一种类型的细胞衰老。DCR2是一种死亡诱饵受体，其可以保护衰老细胞免受免疫系统介导的凋亡，从而阻断对衰老细胞的免疫监视。相似地，自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞激活受体（NKG2D）的配体MICA和ULBP2促进复制诱导，OIS诱导和DNA损伤诱导的衰老。细胞表面标记物的发现具有特殊的意义，因为利用这些标志物，可以对组织中分离的衰老细胞进行定量，分离以及单细胞转录分析。然而，DCR2和NKG2D配体在物种间并不保守，因此小鼠与人类之间不能进行比较。最近，又发现两种上调的细胞表面标记物，分别是在OIS中的Notch1和在复制及OIS中的DPP4。两种蛋白对SASP都具有调节作用。此外，还发现了一种可作为衰老标志物的氧化形式的膜结合Vimentin蛋白，通过适应性免疫系统可靶向表达该蛋白的细胞。最后，衰老细胞可能是通过增加抗凋亡BCL-2家族成员的表达来抵抗凋亡。研究者们利用荧光素酶或荧光蛋白作为报告基因，开发出一些转基因小鼠来评估p16INK4A在体内或体外的表达。研究者们通过对荧光素酶活性的纵向测定发现，随着小鼠年龄的增加，p16INK4A的表达量及动物间的个体差异性也随之增加，分离荧光标记的p16阳性细胞可以进行表型分析。这种方法可以让内源性的p16INK4A启动子来驱动信号，但是会导致p16的杂合状态。另一种小鼠（p16-3MR）使用荧光素酶（rLUC），单体红色荧光蛋白（monomeric Red Fluorescent Protein, mRFP）和胸苷激酶（Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase, HSV-TK）的融合蛋白来进行构建，细菌人工染色体上的p16INK4A启动子驱动整合到小鼠基因组中的该融合蛋白。这种方法能够检测并杀死衰老细胞，且不扰乱内源的CDKN2A位点。最后，INK-ATTAC小鼠表达由p16INK4A启动子驱动的FKBP-Caspase8融合蛋白及增强绿色荧光蛋白（enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP），识别并杀死p16阳性细胞。尽管这些小鼠之间存在着差异，但它们在证明衰老细胞导致多种衰老相关疾病方面有着其自身价值。由p21WAF1/Cip1启动子驱动的荧光素酶和eGFP的小鼠也可以用于此方面研究。研究人员已经开发出一些早衰小鼠模型以模拟人类早衰综合症，包括DNA修复缺陷和基因组完整性缺陷。早衰小鼠衰老更加快速，寿命更短，这便于研究衰老细胞在个体衰老中的作用及测试衰老治疗药物。例如，在BubR1H/H早衰小鼠中，研究人员通过敲除细胞中的p16INK4A减缓了衰老相关的衰退症状，首次证明了衰老细胞与某些衰老表型间有因果关系。BubR1对于有丝分裂中纺锤体组装检查点非常重要。BubR1H/H小鼠仅表达正常水平10% 的BubR1，其异倍性，早衰特征及器官中的衰老标志物表达均表现出上调。从BubR1H/H -INK-ATTAC小鼠中选择性清除p16INK4A阳性细胞可改善驼背，白内障及肌肉萎缩，但不能改善心律失常和动脉壁硬化，也不能延长寿命。相似地，Ercc1-/Δ早衰小鼠由于存在DNA修复缺陷，衰老细胞在其很多组织中加速积累，使其过早地患上多种衰老相关疾病。Ercc1-/Δ小鼠仅表达正常水平5%的对核苷酸切除、链间交联和双链断裂修复都非常重要的核酸内切酶ERCC1-XRF。研究人员使用衰老细胞清除药物治疗Ercc1-/Δ小鼠可减少其衰老标志物的表达，并延长其寿命。儿童早衰症（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS），是由破坏lamin A加工的突变引起的一种部分或组织特异性的早衰症。LMNA突变或缺失的小鼠会出现类似HGPS的表型。通过SA-β-gal染色和衰老标志物的mRNA水平检测，研究人员发现在它们的骨骼肌和心脏中也会积累衰老细胞。这些衰老细胞积累的部位与衰老相关的病理和疾病部位一致。类似地，在进行了LMNA剪接突变的HGPS小鼠模型中，研究人员观察到了肝脏与肾脏的衰老。然而，研究人员还未证明衰老细胞是HGPS的致病诱因。由Xpd基因中一个特殊突变造成的毛状体营养不良（Trichothiodystrophy, TTD）小鼠模型也表明衰老细胞在早衰中发挥着作用。在XpdTTD/TTD小鼠中，细胞衰老在驱动个体衰老中的作用已经通过FOXO4的D逆转录（DRI-）亚型肽治疗能够干扰FOXO4与p53的互作这一事实所清楚地证明。研究人员使用FOXO4-DRI肽治疗XpdTTD/TTD小鼠，降低了小鼠的嗜睡症状，改善了小鼠的皮毛密度，转棒实验能力和对刺激的反应情况。小鼠体内铜锌超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, Sod1）的缺失也会加速衰老。Sod1-/-小鼠肾脏中氧化性DNA损伤增加，衰老相关蛋白（p16INK4A, p21WAF1/Cip1）及SASP因子（IL-1b, IL-6）表达量均增加，SA-β-gal阳性细胞数量增多，衰老相关疾病的发生也增加了。但是，迄今为止，还没有研究人员在Sod1-/-小鼠中证明细胞衰老驱动疾病的发生发展。转录因子NF-κB的抑制性因子NFKB1亚基缺失可诱导小鼠早衰。这些小鼠表现出慢性低度炎症，并由此导致小鼠产生了各方面的衰老表型与较早死亡。然而，与一些广泛使用的早衰小鼠模型相比，这些小鼠的最大寿命仍能达到20个月。此外，这些小鼠在多个组织中的衰老细胞均增加。最后，SAMP1-3 和 SAMP6-11小鼠是由于选择性近亲繁殖AKR/J小鼠所构建的早衰小鼠品系（Senescence-Accelerated Mouse, SAMP）。尽管这些小鼠衰老进程加速，可以用于检测衰老治疗药物，但目前尚不清楚哪些基因突变在这些品系中驱动衰老。在体内，衰老细胞存在于各种组织中。由于SASP它们对于组织的作用可能是局部的，也可能是全方面的。为了理解衰老如何影响组织功能，组织重塑和衰老，我们需要工具来识别组织中的衰老细胞。大多数组织都可以进行单细胞分析。常用的技术包括免疫染色、原位杂交和多色（成像）流式细胞术。甚至更多的标记物可以通过流式细胞术检测（通过移动时间进行血细胞计数[Cytometry by Time-Of-Fligh, [CYTOF]）。这些方法虽然很有作用，但也存在着空间关联信息丢失和不同类型细胞（包括衰老细胞和非衰老细胞）分离效率差异的限制。因此，显微成像仍然是原位衰老检测的首选方法。如前所述，目前还没有针对衰老细胞的绝对特异性的单一标记物。标记的特异性因细胞类型，组织，机体发育阶段，物种和其他因素而异。但是，一些标记具有更普遍的有效性，而另一些则与特定的衰老类型有关。因此，我们建议使用一种结合更广泛和更特异的标记的多标记方法，更准确地在原位检测衰老细胞（图3）。
图3.多标记检测衰老细胞方法的三步工作流程。拟定的工作流程的第一步是检测衰老相关的β半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）或脂褐质的积累量（SBB试剂或GL13试剂）。第二，与在衰老细胞中常见的标志物（p16INK4A, p21WAF1/Cip1）及缺失的标志物（增殖标志物，laminB1）共染色。第三，确定在特定的衰老环境中可能改变的因素。这种多标记的衰老检测方法能够以最高的精度识别衰老细胞。 从细胞水平的研究来说，衰老对于人类疾病的作用显而易见，但是体内研究的证据现在才刚刚开始出现。OIS最初是细胞培养中被发现的第一个在人体内得到验证的衰老类型。在人体内，小鼠的肿瘤前病灶及原发或治疗过的肿瘤中，均证实了肿瘤抑制因子缺失会导致OIS或衰老。后来，关于衰老分泌体的多种报道（见“分泌表型”章节），使人们对其致瘤特性有所认识，建立了现在公认的衰老在致癌过程中的双重作用。最近，有证据表明衰老与其他常见的衰老相关疾病存在着关联。这些疾病包括神经退行性疾病，青光眼，白内障，动脉粥样硬化等心血管疾病，糖尿病，骨关节炎，肺、肾和肝纤维化。在大多数研究中，衰老是通过体外培养或新鲜样本的SA-β-gal染色或甲醛固定组织的间接标记来评估的。由于SA-β-gal不适用于固定组织，因此分析人体样品的衰老具有挑战性。脂褐素是衰老细胞的另一特征，组织化学染料SBB可与脂褐素相互作用。脂褐素能够保存在固定的材料中并可被修复。它是从21万年前的人类化石中分离出来的。最近开发的一种试剂（GL13）可用于免疫组化并能检测出预测预后不良的霍奇金淋巴瘤（Hodgkin Lymphomas, HL）中衰老的霍奇金和里德-斯特恩伯格（Hodgkin and Reed-Sternberg, HRS）细胞。这些细胞体积巨大，并有一个大且偶尔伴随小叶状的核（细胞周期终止的迹象），分泌活动增加，处在炎症环境中，并表现出强烈反映衰老表型特征的组织学特征（图1）。另一种体内鉴定并定量衰老细胞的方法是结显微成像流式细胞术分析的SA-β-gal染色。尽管每种标记物在衰老的检测上都有很好的结果，但并不是所有的衰老模型中都会同时表达这些标记物。我们建议结合细胞质（如SA-β-gal，脂褐素），细胞核（如p16INK4A，p21WAF1/Cip1，Ki67），SASP，环境及细胞特异性的标志物来综合分析（图3）。大约60年前，Hayflick和他的同事首次对细胞衰老进行了描述，在了解衰老细胞的特征和功能方面取得了重大进展。衰老研究的限制仍然是缺乏具体的标志物，特别是对于研究生物而言。我们建议使用多标记物的方法来克服这一障碍（图3）。该策略还可用于评估清除衰老细胞疗法的功效。清除衰老细胞疗法是一种新兴的治疗方法，最近进入临床试验，用于各种衰老相关疾病的治疗。从概念上讲，衰老是一个非线性、多变量的 [F（x,y）=z] 函数，其中的因变量z（结果）取决于自变量x（刺激）和y（环境）。非线性过程由动态遗传和表观遗传过程决定，这些过程可能导致重新编程的循环直到达到稳定状态为止。初看，结果似乎是细胞周期停滞和生物活性分子的分泌。然而，最近的证据表明细胞周期停滞并不总是一个必然的结果。因为有丝分裂后的细胞已经不能增殖，呈现出类似衰老的特征。但在一定条件下，衰老细胞可以重新进入细胞周期。SASP是一种衰老常见的特征，但它是高度多样化的。因此，要了解衰老细胞的多效性表型，需要从传统的还原论转向更系统的、多参数的方法。开发复杂的高通量方法和能够处理多组数据的机器学习工具，将有助于实现这一目标。尽管“旧”与“新”各有利弊，但我们可以结合最佳方法来分析衰老表型的“深渊”。这种方法可能会揭示更具体的与衰老相关的特征，以解决重要的未解之谜：什么引发并调节了SASP？遗传决定因素和表观遗传决定因素如何与刺激和细胞微环境相互作用？哪些基因组修复系统在不同的衰老情况下发挥功能？什么导致细胞逃逸生长停滞？“逃逸”的衰老细胞具有怎样的表型？这些问题和其他问题的解答将有助于为每种亚型的衰老建立特定的标志物组（见图3第3步），并指导衰老治疗领域的发展，从而在精准医疗中实现最佳效果。原文：Vassilis Gorgoulis, Peter D. Adams, Andrea Alimonti et al., CellularSenescence: Defining a Path Forward, Cell, 179 （2019）. 责编：王思 排版：陆小炮
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