一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法

文档序号：1274196

一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法

【专利摘要】本发明公开了一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，该方法通过改进传统的酸水解工艺，将提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣加入酸水解液中，磁力搅拌下水解后，继续超声处理，得提取液，调节提取液pH，离心，收集上清液，向上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，并旋蒸至干，即制备得荔枝中溶剂难溶结合态多酚。该方法步骤简单，耗时短，水解温度低，荔枝难溶结合态多酚得率高。
【专利说明】一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于荔枝多酚【技术领域】，具体涉及一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法。
【背景技术】
[0002]近来的大量流行病学调查结果提示增加新鲜蔬菜水果的摄入量对于降低癌症等多种慢性疾病的发病率有重要意义。研究同时指出新鲜蔬菜水果中富含的多酚类物质是发挥这些健康促进作用的重要的活性成分。多酚是广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子等部位的一大类植物次生代谢产物。植物多酚以游离态和结合态两种形式存在。游离态多酚是指采用常规的溶剂浸提方法可以提取得到的，没有与植物细胞内其它大分子物质相结合的多酚类物质。通常研究中所涉及的也主要是这一类多酚。此外，植物体内还有一部分多酚类物质通过酯键与植物细胞壁上的多糖、纤维素等大分子物质共价结合，被称为结合态多酚。这些酚类物质不能通过常规的溶剂浸提方法被提取出来，因此，在研究中这部分酚类物质往往被忽略。然而，随着人们对酚类物质的健康保护作用认识的不断深入，近年来，研究人员发现结合态多酚的健康保护作用有其自身的优势。由于这种结合态多酚受所结合的大分子成分保护，在上消化道内不会被人体吸收和破坏而进入到大肠，在细菌的分解作用下缓慢释放后经粘膜吸收入血，从而成为人体内持续的多酚供应来源。因此，深入研究不同植物结合态多酚的组成及含量对全面了解不同来源植物多酚的生物活性具有重要意义。
[0003]植物结合态多酚有多种提取方法，常用的有酸水解提取和碱水解提取。目前关于结合态多酚研究比较多的是玉米、水稻等谷物，研究者多用碱水解提取方法制备其结合酚。而对于水果、蔬菜中的结合酚的提取方法研究较少，研究者多沿用谷物的碱水解提取方法，并没有对碱水解提取方法对果蔬结合酚的提取效果进行评价。由于谷物与果蔬中的酚类物质的构成种类有较 大的差别，前者以酚酸为主，而后者含有较多的黄酮类化合物。由于这种酚类物质构成上的差异，使得碱水解方法并不一定适合果蔬结合态酚类物质的提取。因此，针对不同的材料，需要优化确立其适合的结合酚制备方法。此外，目前使用的碱或者酸催化水解制备结合态多酚的方法都存在操作步骤烦琐，温度高，耗时过长等缺点。因此，急需对现有的方法进行改进。
[0004]荔枝是一种重要的亚热带特色水果，深受国内外消费者的喜爱。研究发现荔枝果肉中酚类物质含量较高，并具有较强的抗氧化活性，为其重要的活性成分。同时研究还发现荔枝果肉中的结合态酚类物质含量较高，在某些品种中占总酚含量的近30%。然而上述研究结果也是在直接应用碱水解制备结合态多酚的基础上得到的，并没有对结合酚的制备方法进行比较和优化。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，该方法步骤简单，耗时短，水解温度低，荔枝结合态多酚得率高。[0006]本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的:一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，含以下步骤:
(1)制备酸水解液，取浓盐酸，维生素C水溶液和甲醇，配制成酸水解液；
(2)取提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣，加入步骤(1)制备的酸水解液中，磁力搅拌下调节温度为55飞5°C水解I h，然后继续超声处理2(T40 min，并重复磁力搅拌水解和超声处理1-2次，得提取液；
(3)调节提取液pH至2-3，离心后，收集上清液；
(4)向上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，并旋蒸至干，即制备得荔枝中难溶结合态多酚。 
[0007]本发明主要是对传统的酸水解方法进行了改进，主要包括降低酸水解液中的盐酸的浓度，在水解液中添加维生素C作为抗氧化剂防止提取过程中结合态多酚的氧化分解；同时降低水解时间以减少热处理造成的结合态多酚的分解；另外，还将加热提取和超声提取相结合，从而缩短提取时间，经过上述多方面的改进，可以提高结合态多酚的提取物得率以及提高结合态多酚的细胞抗氧化活性。
[0008]本发明步骤(1)中浓盐酸的体积百分含量为20-35%(此时浓盐酸的浓度为2.4^4.2mol/L),甲醇的体积百分含量为40飞0%，余量为维生素C水溶液。
[0009]本发明维生素C水溶液中维生素C的质量百分含量为0.8^1.2%。
[0010]本发明步骤(2)中提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣的提取过程优选如下:将新鲜的荔枝果肉与冰冻的丙酮水溶液混合打浆，搅拌提取后，匀浆处理，将匀浆液离心，取沉淀物采用冰冻的丙酮水溶液再次提取，经两次提取之后所剩余的沉淀，经干燥处理，即得提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣。
[0011]采用这种方法提取游离态多酚，游离态多酚的提取程度高，可提取出来新鲜荔枝果肉中的绝大部分游离态多酚，从而为下一步结合态多酚提取效率的获取提供依据。
[0012]本发明所述的冰冻的丙酮水溶液中丙酮的体积百分含量优选为70-80%，新鲜的荔枝果肉与冰冻的丙酮水溶液的质量体积比优选为1:2~3 (单位:g/mL)，搅拌提取时间优选为5~10 min，离心时使用冷冻离心机，离心速度优选为3000~5000 rpm，温度优选为4°C，离心时间优选为1(T15 min。
[0013]本发明所述的冰冻的丙酮水溶液中丙酮的体积百分含量最佳为80%，新鲜的荔枝果肉与冰冻的丙酮水溶液的质量体积比最佳为1:2 (单位:g/mL)，搅拌提取时间最佳为5min，离心时使用冷冻离心机，离心速度最佳为3000 rpm，温度为4°C，离心时间为lOmin。
[0014]本发明步骤(2)中荔枝果肉残渣与酸水解液的质量体积比优选为1:5~15 (单位:
g/mL)ο
[0015]本发明步骤(2)中取提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣，加入步骤(1)制备的酸水解液中，优选磁力搅拌下调节温度为60°C水解lh，然后继续超声处理30min，并重复磁力搅拌水解和超声处理1-2次，得提取液；超声处理时超声设备的功率为45(T750W。
[0016]本发明步骤(3)中离心时离心设备的转速优选为300(T5000 rpm ;离心时间优选为 10~15min。
[0017]本发明步骤(4)中向上清液中加入等体积乙酸乙酯进行萃取，共萃取4飞次，合并有机相，并在40°C以下旋蒸至干，即制备得荔枝难溶结合态多酚。[0018]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
(1)传统的酸水解方法烦琐、耗时，提取时间达18h之久，而本发明方法简单，耗时短，可以将提取时间缩短到4.5h以内；
(2)传统的酸水解方法需要在较高温度下(80°C)进行提取；提取温度相对较低，可以将提取温度降低至60°C以下，从而可以减少热处理造成的结合态多酚的分解；
(3 )传统的酸水解方法中酸水解液中盐酸的浓度高，而本发明方法降低了酸水解液中盐酸的浓度，可降低至2.4 mo I/L ；
(4)本发明方法将加热提取和超声提取相结合，可以大大缩短提取时间；
(5)采用本发明方法提取结合态多酚，结合态多酚得率相对传统酸水解方法具有显著提高，细胞抗氧化活性也有显著提高。
【具体实施方式】
[0019]由于荔枝果肉中游离态多酚的提取效率会影响到果肉残渣中结合态多酚的提取效果的评价，为了尽量完全的提取游离态多酚，本发明对以下几种不同溶剂对荔枝果肉中游离态多酚的提取效果进行了比较。
[0020]取新鲜荔枝果肉150 g，分别选用体积百分含量为80%的冰冻的甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯作为提取溶剂各300 mL与荔枝果肉搅拌破碎5 min，破碎后的荔枝果肉混合物用匀浆机4 °C匀浆5 min，所得匀浆液用低温冷冻离心机3000 rpm离心10 min，分离上清，沉淀用300 mL上述提取溶剂重悬,4 °C下再次匀衆5 min,低温冷冻离心机3000 rpm离心
·10min后合并两次离心的上清液，45 °C旋蒸至干。将提取物用提交百分含量为85%的甲醇水溶液定容至50 mL，用于福林酚法总酚含量的测定(测定方法如上所述)，具体结果如表I，从表1中可以看出，四种提取溶剂中，80 %丙酮提取得到的游离态多酚是最多的，即80 %丙酮可以较完全的提取出荔枝果肉中的游离态多酚，因此在本发明以下实施例中所用的荔枝果肉残渣均为用80%丙酮提取游离态多酚之后所得。
[0021]表1不同提取溶剂提取到的荔枝果肉中总酚含量(mg没食子酸当量/100g新鲜果肉)
溶剂类型P [ 总酚含量- ~I
SO % 甲醇P190.69±3,69bv I
I—I
80% 乙醇P171Jl±3,42c^ '

80 % 丙 Ifw210.67±9J5a^
_I__—I
TOM 乙駿乙藤 P [ 151.79±5.7Qd^ [
实施例1
(1)酸水解液的制备:浓盐酸:0.8 %维生素C水溶液:甲醇=3:2:5 (v:v:v);其中浓盐酸为市售产品，一般指浓度为12 mo I/L的浓盐酸；
(2)荔枝果肉残渣的获取:为提取新鲜荔枝果肉中的游离态多酚之后的荔枝果肉残渣，获取的具体过程为:将新鲜的荔枝果肉与冰冻的80% (体积百分含量)丙酮水溶液按1:2(w/v, g/mL)混合打衆,搅拌提取5 min后,在将混合物用匀衆机在4°C下匀衆5 min,所得的匀浆液经3000 rpm离心10 min，沉淀用冰冻的80%丙酮(体积百分含量)水溶液再次提取，经两次提取之后所剩的沉淀挥干水分后即为荔枝果肉残渣；
(3)称取提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣10 g加入平底烧瓶中，加入100 mL酸水解液，磁力搅拌下60°C水解I h，之后将烧瓶放入超声波粉碎机中450 w超声处理0.5 h，重复上述循环2次(指磁力搅拌水解以及超声波超声处理过程)；
(3)向提取液混合物中加入浓度为10mol/L的NaOH中和至pH 2 ；
(4)将中和后的提取液混合物3000rpm离心10 min,收集上清液；
(5 )向上清液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取6次，合并有机相，得乙酸乙酯萃取液；
(6)将乙酸乙酯萃取液在40°C旋转蒸发至干，得荔枝结合态多酚提取物148 mg;多酚提取物得率(％ )=多酚提取物干粉重量/步骤三中称取的果渣重量；
(7)将蒸干后的萃取物用磷酸盐缓冲液溶解定容至25mL，得荔枝果肉结合态酚类物质提取液，-80 °C保存，待测。
[0022](8)提取物多酚含量测定:多酚含量参照文献报道(Dewanto V, Wu XZ, AdomKKj Liu RH: Thermal Processing Enhances the Nutritional Value of Tomatoes byIncreasing Total Antioxidant Activity.J Agric Food Chem 2002，50:3010-3014)米用福林酚法测定，具体如下:在5 mL试管中加入0.5 mL蒸馏水，再加入125 μ L上述提取液或者125 μ L不同浓度的没食子酸标准品溶液，最后向各管中加入125 μ L福林酚试剂。6 min后再向试管中加入1.25 mL质量百分浓度为7%的Na2CO3溶液和I mL蒸馏水，混合均匀后室温下避光反应90 min，用紫外可见分光光度计760nm波长下测定吸光度值，多酚含量以没食子酸当量计。
[0023](9)细胞抗氧化活性测定:参照文献方法进行(Wolfe KL, Kang X，He X，Dong Μ,Zhang Qj Liu RH: Cellular Antioxidant Activity of Common Fruits.J Agric FoodChem 2008，56:8418-8426)。将处于对数生长期的HepG2细胞接种到黑色底部透明的96孔板中，细胞密度为5 X IO4/孔，CO2培养箱中37 °C培养24 h后，吸除培养基，向各孔中加入含有不同浓度槲皮素标准品或待测的上述荔枝果肉残渣结合态多酚提取物的无血清培养基，培养基中同时添加终浓度为25 μ M的DCFH-DA继续在CO2培养箱中培养I h，对照孔和空白孔更换的无血清培养基中只加入DCFH-DA。取出培养板，吸弃各孔中培养基，立即加Λ 200 μ L含有600 μ M AAPH的平衡盐液(HBSS)，空白孔中加入不含AAPH的HBSS。立即将培养板置入提前预热至37°C的多功能酶标仪中进行测定荧光强度。吸收波长538nm，发射波长485nm，每隔5 min测定一次，共测定I h。每个相同的处理设定三个复孔。根据各孔不同时间点荧光强度(Y)与各时间点(X)做图，计算荧光曲线下面积。根据曲线下面积变化，以槲皮素为参照，计算样品的CAA值。为了方便比较，样品的CAA值以ymol槲皮素当量/100 g果渣计。 
[0024]实施例2
(1)酸水解液的制备:浓盐酸:1%维生素C水溶液:甲醇=2.5:3:4.5 (v:v:v);其中浓盐酸为市售产品，一般指浓度为12mol/L的浓盐酸；
(2)称取提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣10g加入平底烧瓶中，加入100 mL酸水解液，磁力搅拌下60°C水解I h，之后将烧瓶放入超声波粉碎机中750 w超声处理0.5 h，重复上述循环I次(指磁力搅拌水解以及超声波超声处理过程);
(3)向提取液混合物中加入浓度为10mo I/L的NaOH中和至pH 3 ；
(4)将中和后的提取液混合物3000rpm离心15 min,收集上清液；
(5)向上清液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取5次，合并有机相，得乙酸乙酯萃取液；
(6)将乙酸乙酯萃取液在40°C旋转蒸发至干，得荔枝结合态多酚提取物140 mg。
[0025]实施例3
(1)酸水解液的制备:浓盐酸:1.2 %维生素C水溶液:甲醇=3:1:6 (V: V: V);其中浓盐酸为市售产品，一般指浓度为12mol/L的浓盐酸；
(2)称取提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣5g加入平底烧瓶中，加入75 mL酸水解液，磁力搅拌下60°C水解I h，之后将烧瓶放入超声波粉碎机中600 w超声处理0.5 h，重复上述循环2次(指磁力搅拌水解以及超声波超声处理过程)；
(3)向提取液混合物中加入浓度为10mo I/L NaOH中和至pH 2 ；
(4)将中和后的提取液混合物4000rpm离心10 min,收集上清液；
(5 )向上清液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取4次，合并有机相，得乙酸乙酯萃取液；
(6)将乙酸乙酯萃取液在40 °C旋转`蒸发至干，得荔枝结合态多酚提取物99.5 mg。
[0026]为全面评价荔枝酚类物质的生物活性提供方法学基础，由于碱水解方法是目前较普遍使用的结合酚提取方法，本发明提取得到的荔枝果肉结合态多酚与采用碱水解方法得到的结合态多酚从总酚含量以及抗氧化活性等方面进行了比较。
[0027]对照实施例1 传统碱水解方法提取
具体步骤如下:收集提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣，按重量体积比1:10(g/mL)加入2 mol/L的NaOH，在氮气保护下，室温下搅拌水解18 h，混合物用浓盐酸中和至pH 2，3000 rpm离心15 min，收集上清液，用等体积乙酸乙酯萃取6次，合并有机相，35 °C旋蒸至干，用PBS溶解提取物干粉，-80 °C冻存待测。
[0028]对照实施例2 传统酸水解方法提取
具体步骤如下:收集提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣，按重量体积比1:10(g/mL)加入6 mol/L的HC1，置于密闭的容器中，混合物在80°C磁力搅拌下水解18 h，用10mol/L的NaOH中和至pH 2,3000 rpm离心15 min，收集上清液，用等体积乙酸乙酯萃取6次，合并有机相，35 1:旋蒸至干，用PBS溶解提取物干粉，-80 °C冻存待测。
[0029]为了解该方法对荔枝果肉结合态多酚的提取效果，将实施例1方法提取得到的结合态多酚与传统碱水解方法(对照实施例1)和酸水解方法(对照实施例2)提取的荔枝果肉结合态多酚从总酚含量、细胞抗氧化活性进行了对比。
[0030]将上述三种不同方法(实施例1、对照实施例1和对照实施例2)提取得到的荔枝果肉结合态酚类物质提取液采用福林酚法测定总酚含量，采用CAA法测定细胞抗氧化活性，测定结果如下表2所示。[0031]表2不同方法提取荔枝果渣中结合酚含量及其抗氧化活性
【权利要求】
1.一种荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是含以下步骤: (1)制备酸水解液，取浓盐酸，维生素C水溶液和甲醇，配制成酸水解液； (2)取提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣，加入步骤(1)制备的酸水解液中，磁力搅拌下调节温度为55飞5°C水解lh，然后继续超声处理2(T40min，并重复磁力搅拌水解和超声处理1-2次，得提取液； (3 )调节提取液pH至2-3，离心后，收集上清液； (4)向上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，并旋蒸至干，即制备得荔枝中难溶结合态多酚。
2.根据权利要求1所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:步骤(1)中浓盐酸的体积百分含量为20~35%，甲醇的体积百分含量为40~60%，余量为维生素C水溶液。
3.根据权利要求2所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:维生素C水溶液中维生素C的质量百分含量为0.8^1.2%。
4.根据权利要求1所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:步骤(2)中提取游离态多酚之后的荔 枝果肉残渣的提取过程如下:将新鲜的荔枝果肉与冰冻的丙酮水溶液混合打浆，搅拌提取后，匀浆处理，将匀浆液离心，取沉淀物采用冰冻的丙酮水溶液再次提取，经两次提取之后所剩余的沉淀，经干燥处理，即得提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣。
5.根据权利要求4所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:所述的冰冻的丙酮水溶液中丙酮的体积百分含量为70-80%，新鲜的荔枝果肉与冰冻的丙酮水溶液的质量体积比为1:2~3，搅拌提取时间为5-~10 min，离心时使用冷冻离心机，离心机转速为3000-~5000 rpm，温度为4°C，离心时间为10-~15 min。
6.根据权利要求5所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:所述的冰冻的丙酮水溶液中丙酮的体积百分含量为80%，新鲜的荔枝果肉与冰冻的丙酮水溶液的质量体积比为1:2，搅拌提取时间为5min,离心时使用冷冻离心机,离心机转速为3000 rpm,温度为4°C，离心时间为10 min。
7.根据权利要求1所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:步骤(2)中荔枝果肉残渣与酸水解液的质量体积比为1:5~15。
8.根据权利要求1所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:步骤(2)中取提取游离态多酚之后的荔枝果肉残渣，加入步骤(1)制备的酸水解液中，磁力搅拌下调节温度为60°C水解lh，然后继续超声处理30min，并重复磁力搅拌水解和超声处理1_2次，得提取液；超声处理时超声设备的功率为45(T750W。
9.根据权利要求1所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:步骤(3)中离心时离心设备的转速为3000~5000rpm,离心时间为10~15min。
10.根据权利要求1所述的荔枝中难溶结合态多酚的制备方法，其特征是:步骤(4)中向上清液中加入等体积乙酸乙酯进行萃取，共萃取4飞次，合并有机相，并在40°C以下旋蒸至干，即制备得荔枝难溶结合态多酚。
【文档编号】A61K36/77GK103705620SQ201310696508
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日 
【发明者】张瑞芬, 张名位, 张雁, 魏振承, 邓媛元, 郭锦欣, 遆慧慧, 唐小俊, 刘磊, 马永轩 申请人:广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所, 广东宝桑园健康食品有限公司