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8F/1492R使用最普遍，效果的确不错；但我们的经验是sgF/sgR（上海生工公司扩16S 推荐的引物）效果更好。这2对引物对应的PCR 产物都在1.5kb 左右。 这对引物也是我们用过的，效果很好。对应的PCR 产物约90bp （V6区平均长度80-100bp ，一说79bp ）。 引物到后，先在迷你离心机上短暂离心，将黏附在管口、管壁、管盖的核苷酸粉末甩到管底，然后在超净台操作（因为16S 序列所有细菌里都有，扩增时很容易混入杂菌，因此本实验涉及的每一种试剂、耗材都要非常小心，保证无污染）：按照引物合成单的说明，加入灭菌的TE 缓冲液，如果没有，灭菌的双蒸水也行（注意每OD 加入量不等于最终加入量，一般引物合成是2OD ）。溶解核苷酸粉末后，用枪头吹吸混匀。取5μL 溶液转移到另一个灭菌的EP 管，加入45μL 灭菌的双蒸水，即稀释10倍，此时引物浓度为10μM ，也就是工作浓度。最好分装保存，避免多次使用导致反复冻融，造成引物不稳定。 以genomic DNA为模板，最适模板量为0.1-10 ng，多了可能引发非特异性扩增，少了可能扩不出来，所以要先稀释。PCR 体系建议25μL ，效果远好于50μL 。推荐用TAKARA 的LA Taq （保真度是普通Taq 的6.5倍，扩增效率也较高）或FINNZYMES 的Phusion （保真度是普通Taq 的50倍，pfu 的6倍），以保证16S 测序结果可信。 PCR 体系： 模板 1μL 引物F 0.5μL 引物R 0.5μL dNTP （10 mM） 0.5μL LA Taq（5U/μL ） 0.5μL 10×PCR buffer 2.5μL 灭菌水 19.5μL 总体积 25μL 模板 1μL 引物F 0.5μL 引物R 0.5μL Phusion 12.5μL 灭菌水 10.5μL 总体积 25μL 注意：1、PCR 加样过程要在超净台进行。操作前先开紫外灯30 min，关闭后再开风机10 min，再用酒精棉球清洁台面和双手，方可开始操作。 2、一定要做阴性对照（不加模板，其余成分都加）！ 3、所用PCR 管、枪头、水均须严格灭菌。 4、加样过程中，每一管管盖开的时间不要太久，加完立刻扣上盖子，再加下一管，避免交叉污染（genomic DNA浓度通常很高，在空气中容易逸散）。 5、加样在冰盒上操作，加完轻轻吹吸，短暂离心，保证各组分均匀混合。 PCR 程序： 针对全长： 94℃ 4 min 94℃ 30 s 65℃ 40 s 72℃ 90 s 72℃ 10 min 4℃ ∞ 针对V6区： 94℃ 4 min 94℃ 30 s 55℃ 30 s 72℃ 10 s 72℃ 5 min 4℃ ∞ 注意：Phusion 的扩增效率较LA Taq低，所以如果Phusion 扩不出，可适当增加3-5个循环数。 电泳检测： 配制1%（16S 全长）或3%（V6区）琼脂糖凝胶——样品PCR 产物和阴性对照PCR 产物各取4μL ，混合0.5μL 6×loading buffer点样，并点DL2000 Marker（16S 全长）或50 bp ladder Marker （V6区）——1×TAE ，115V ，电泳45-60min ——EB 染色15 min——紫外凝胶成像仪拍摄电泳照片 正确的结果应该是：1.5kb 单一亮带（16S 全长）或稍小于100bp （V6区）单一亮带，阴性对照无条带。 |
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