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安捷伦（Stratagene） 说到定点突变，我们怎么能忘了QuikChange呢？这个明星产品被数以千计的文献所引用，成为许多突变实验的首选。如今，Stratagene公司已被安捷伦科技公司收购，但仍在不断提供新的产品，比如这款俗称闪电的QuikChange Lightning定点突变试剂盒。 QuikChange系列试剂盒也利用DpnI来去除甲基化的亲本质粒，不过它的引物设计策略与Q5不同，是使用两条直接互补的寡核苷酸，各自包含突变。这些引物退火和延伸后，产生了带切口的质粒，在转化大肠杆菌后修复。由此可见，突变过程分为简单的三步。首先使用热循环仪合成突变链，然后使用DpnI降解亲本DNA模板，最后通过转化步骤完成实验。
安捷伦认为，这种线性扩增策略只以亲本DNA作为模板进行扩增，能减少不必要的错误。由于循环次数少而模板的起始量较高，因此确保了以最少的错配进行稳定的线性扩增。这种非PCR的方法结合保真度超高的聚合酶，几乎可完全消除不需要的第二位点突变。 之前的QuikChange版本使用的是PfuUltra高保真DNA聚合酶，Lightning新版本则采用专利配方的QuikChange Lightning DNA聚合酶。这种融合型的聚合酶具有增强的持续合成能力，极为准确和高效，能扩增长片段的目标序列，且延伸速度更快（30秒/kb）。而新的DpnI酶将消化时间从1小时缩短到5分钟。因此，QuikChange Lightning试剂盒可以在三小时内引入点突变、插入突变或缺失突变，随后进行过夜转化。 这个试剂盒中包含了QuikSolution试剂，可促进大片段质粒的复制。因此，它适合富含GC的复杂质粒或长达14 kb的大片段质粒。此外，QuikChange系列还有多点突变试剂盒，可同时在五个不同位置上对质粒DNA进行定点突变；而QuikChange HT能产生最多含12万个重组突变体的大型突变库，适合蛋白质工程研究。 赛默飞世尔 Phusion高保真聚合酶大家也许用过，至少听说过。以这款酶为核心，赛默飞世尔也推出了Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit，可在任何类型的质粒DNA中引入点突变、插入或缺失。它的突变策略与Q5相似，都是采用背对背的引物，扩增突变的DNA。这种方法的好处是能够在引物的5’端加上一条尾巴，而插入较长的片段（100 bp左右）。Phusion Hot Start II DNA聚合酶在突变过程中发挥重要作用，以其高保真性而减少了不想要的二次突变，适用于10 kb以下的质粒。 整个操作流程与Q5相似，不过少了一个降解起始模板的步骤。该公司认为，在这种方法中，痕量的模板DNA被指数扩增，因此未突变模板所占的比例是极小的，也就没有必要在单独的步骤中破坏它。不过，需要注意的是，这个试剂盒需要磷酸化的引物，因为试剂盒中含有T4 DNA连接酶，而非激酶。 Clontech Clontech的In-Fusion克隆系统听上去像是个做克隆的，其实它也能用于定点突变。它结合In-Fusion HD酶以及反向PCR扩增，实现了各种突变。突变中所采用的两条引物有着相反的方向，但5’端有着15 bp的重叠，并掺入了感兴趣的突变。 在实验过程中，首先是设计引物，然后利用高保真的CloneAmp HiFi DNA聚合酶开展PCR反应，得到线性的PCR产物。之后再开展In-Fision反应，利用重叠的15 bp让线性DNA重新环化，接着就是转化和筛选了。CloneAmp HiFi这种酶的性能也是杠杠的。根据Clontech的数据，它的延伸速度极快，每kb只需5秒。此外，错误率也很低，复杂模板上大约每45200个碱基有一个错配。
环化过程就是著名的In-Fusion反应。凭借In-Fusion酶独特的末端接合能力和15 bp重叠，线性DNA就能轻松环化。当然，这种克隆体系也兼容任何载体。对于普通克隆，只要载体和插入片段的末端有15个相同的碱基，克隆就能轻松完成，就是这么任性。 应用 研究人员可以利用定点突变来实现多个体外应用，不过最广泛的应用还是改变表达载体上的氨基酸。另外一个应用是插入比较短的序列（最多100 bp），比如蛋白质标签，或者在当下热门的CRISPR应用中，插入向导RNA序列。这可以通过Q5或Phusion定点突变试剂盒来实现。 当然，DNA合成正变得越来越便宜，研究人员也可以选择合成突变基因，而不是改变现有的序列。不过，对于大多数实验室而言，基因合成仍然是比较贵的。随着价格的下降，这种局面可能会改变，不过就目前而言，定点突变试剂盒仍是个好选择。（生物通 余亮） |
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