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我们在引物设计那一篇推送中已经介绍过质粒以及质粒载体，我们曾经把质粒载体比喻成一个生产蛋白的机器，把大肠杆菌比喻为生产车间。当我们获得目的片段之后，我们需要组装到机器上面，才能让车间生产目的蛋白。目的片段是通过酶切位点与质粒载体完美组装的，这点在我们设计引物时已经重点强调过。 这篇推送中，我们将介绍酶切目的片段与目的载体，片段与载体连接，转化，测序。 Step 12 片段酶切 用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切step11中回收的目的片段并回收，将细节填入载体构建流程表格step12。限制性内切酶我们使用的是takara公司的快切酶，NEB的酶据说也很好用，酶就尽量选择同一家公司的买。切胶回收步骤在上一篇推送中有介绍过。 Step 13 载体酶切 提质粒 我们仍旧以pET28a为例，pET28a携带的抗性基因是氨苄青霉素（Amp）抗性，将含有pET28a的大肠杆菌菌株接种在含有Amp的LB中生长，抗生素的压力可以让大肠杆菌生产大量的pET28a质粒。如果购买的是质粒而不是携带质粒的菌株，则需要将质粒转化到大肠杆菌中再进行接种。 提质粒是经典的分子生物学实验，这里不再赘述，可在质粒提取试剂盒说明书或者分子克隆书上学习相关知识和步骤，如果使用试剂盒过程中遇到任何问题都可以问销售问公司技术人员，从他们那里也可以学到很多哟。 将接菌比例，培养的菌液量，提取质粒的浓度（可通过nanodrop检测或者电泳检测）记录在载体构建流程表格的step13中，如果结果异常，后期就要根据结果调整接菌比例和菌液量。 注意：如果甘油管存菌太久，三个月或半年以上，建议先将甘油管存的菌在带相应抗性的LB平板上活化，最好是划线获得单克隆，再接种到液体培养基，进行质粒提取。 质粒酶切 用与酶切片段相同的限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切质粒pET28a。对得到的酶切载体进行回收，电泳结果应出现两条带，一条为5000bp左右的长片段，是我们需要的载体片段，另外有一条几十bp左右的小片段。切下长片段，进行胶回收，并检测回收后的片段浓度。 载体去磷酸化（可选步骤） 同时我们还用Thermo公司的FastAP对载体进行了去磷酸化，以避免载体自连。 原因：载体去磷酸化后因自身5'端无磷酸基团，不可以和自身3'端连接。但是，载体去磷酸化后3’还是有羟基的，可以与目的片段的5'端磷酸基团连接。载体的5'端和目的片断的3’-OH不能成键，因而形成一个双链各有一个切口的双链环状DNA，双链的切口会在转化入大肠杆菌后，在复制的过程中被修复。 将上述步骤相应的数据填入载体构建流程表格中的step13 至此，我们获得构建蛋白表达机器的全部组装元件。接下来我们将酶切好的载体和片段连接起来，并转化到大肠杆菌中。 Step 14 连接体系 （1）试剂准备：我们用的takara公司的连接酶试剂盒,也可以用T4连接酶+ligation buffer （2）混合：将酶切好的质粒和目的片段混合制备成体积为 5μl 的 DNA 溶液。 说明书建议：载体 DNA 和插入片段 DNA 的摩尔数比一般为 0.03 pmol ：0.03-0.3 pmol（0.03 pmol 的 pUC18 DNA（2,686 bp）大约为 50 ng）也就是说加入片段要比载体DNA多，可考虑选择1μL载体+4μL片段+5μL Solution Ⅰ的混合体系。 （3）加入试剂：向上述 DNA 溶液中加入等体积（5-10 μl）的 Solution I，充分混匀。 （4）在PCR机中设定好程序，16℃反应过夜。 Step 15 转化 连接好的10ul反应液直接转化大肠杆菌感受态，如果执行的转化步骤与经典的转化步骤不同，需要备注到载体构建流程表格中，在出现异常结果后可以反推自己哪里出错。把转化长出的单克隆的个数（表中为转化子个数）记录到表格中。 Step 16 测序 联系测序公司测序，测序时最好使用载体的测序通用引物（公司通常会有），如果没有，也可以使用pcr引物测序。一定要保证测到所有的目的序列，特别是首尾序列。测序步骤中有任何不懂的问题都可以咨询测序公司的销售和技术，他们都可以回答。 测序结果可利用snapgene，DNAMAN等DNA分析软件比对，软件下载和使用方案可以在网站上查找。 在进行以上步骤时，记得将数据记录在载体构建流程表格中。 填写示例如下：
后记 总结一下我们的载体构建攻略的全部推送：最希望分享给大家的是我们的载体构建流程表格，这是策略，好的策略让你在走弯路之后还能回到正道上，初学者特别建议创建属于自己的载体构建流程表格，然后一步一步的进行；其次我们也举了具体的例子，尽量的给了非常非常多的细节，为了大家可以看了这些推送，对载体构建有一个完整概念，知道从哪里入手，知道遇到问题应该怎么解决，不用再去读更多的关于载体构建的文章，在实验过程中如果遇到具体问题再具体分析就可以；那遇到问题怎么办呢，整理好自己的问题，先自己尝试回答看看，如果没有思路，可以后台留言，网上查找，问公司技术，问做过的师兄师姐。 为了更好的表述，我们举了很多具体的例子，里面包含具体的数据，但是请注意，这些数据只是为了说明怎么去使用载体构建流程表格，再没有别的意义了。 祝大家可以实验顺利！ |
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