来源:科研小助手公众号 正所谓自己动手丰衣足食!所以还是自己构建吧!啥?不会!没关系,本文正合适啥都不会的实验小白!嗯?我已经会了!没关系,相信你读完本文之后也会受益良多的!(Note:因本系列文章主要面向实验小白,所以写的非常详细,已经掌握所述技能的可以略过)好了,小编就不在废话了,让我们简单粗暴的直接进入主题吧! 读完本文您将获得以下技能 0. 学会获取目的基因的CDS序列; 引物设计 通常我们要通过PCR获取目的基因片段,所以质粒构建第一步就是设计引物。首先大体了解一下引物设计的一些通用原则: 1. 引物长度一般在15~30 bp,最常用的是18~27bp; 2. 引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好在72℃左右。Tm值简单粗暴的计算方法为Tm=4×(G+C)+2×(A+T),或在此基础上减5℃; 3. 引物3’端不能选择A,最好选择T,G/C的错配率介于A/T之间; 4. 以上为最主要的原则,另外还要注意引物的特异性、引物内部不能形成二级结构等原则,具体可以百度之; 当然以上原则并不一定非要完全符合,但是作为一个新手而言初期最好是严格遵守为妙。下面就以构建人源PD1(PDCD1)为例为大家讲解。 CDS的获取 要设计引物自然要知道这个基因的CDS序列了。获取一个基因CDS序列的方法如下: 然后第一条就是我们需要的序列信息,点击进去,往下拉,直到看到CDS(如下图) 点击CDS,就出现了下图中所示内容,其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了,可以看到这段序列开头是ATG起始密码子,最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。 还可以点击右下角的FASTA得到下图所示内容,这边也可以方便的复制目的基因的CDS序列。 由于需要PCR整个CDS区域,所以正反向引物并没有多少选择的余地,甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物,例如:
Primer 5的使用 如下图,首先点击File->New->DNA Sequence,
下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。 点击左上角的Primer,如下图,S=Sense,A=Antisense 如果对现在的引物不满意,还可以点击Edit Primers编辑序列,如下图,我们删除掉末尾三个碱基,之后需要先点击Analyse,然后才能点击OK,我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。 最后点击Edit->Copy->Sense Primer,粘贴到Word中即可得到正向引物,反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便,Primer 5还有很多强大的功能,你可以自行探索,也可以加小编微信(amateur_1988)拉入官方微信群交流。 这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因,现在的引物就可以送去合成了,但是如果你想将其构建到载体上,那么我们还要对其进行进一步的加工。 Primer 5的使用 根据不同的目的,可以选择不同的载体,如过表达(pcDNA 3.0)、敲减(pLKO.1-TRC)、原核纯化(pGEX-4T1、pET-28a)、病毒包装(pMSCV-puro)、敲除(lentiCRISPR v2)等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。
所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。 还是打开Primer 5,然后粘贴CDS序列,点击Enzyme,2为所有的酶,我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶,双击即可到3的框中,选好之后点击OK,可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点,所以这两个不可以选,其他的都可以选。
于是我们得到如下引物:
质粒构建 终于到正题了! 待引物合成之后,我们用ddH2O将其稀释到100 μM作为母液,取一些稀释到10 μM做下一步实验了。 首先我们P出目的基因,这一步建议用高保真PCR酶,小编常用的是Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶。反应体系及反应条件如下图: 模板的获取 1. 找到表达(最好高表达)该基因的细胞或者组织,用TRIzol法抽提RNA,然后用反转录试剂盒得到相应的cDNA作为模板; 2. 免费索取。给大家推荐一个可以免费索取cDNA的地址:http://hanlab.。韩家淮院士为大家免费提供cDNA,只需要进入该网址点击左侧导航栏的“cDNA索取”即可免费获取韩家淮院士实验室的cDNA了! PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段,也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切,同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶,还可以打开网址http:///RVuwBVo查询双酶切所用的最佳Buffer。 酶切回收之后的片段进行连接,小编使用的是Thermo公司的T4连接酶,体系如下: 现在的T4连接酶基本都是快酶,比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成,不过小编保险起见,一般连接30 min,切勿连接过夜! 连接完成之后便是转化,挑菌(单克隆),摇菌抽提质粒,送去测序就OK了! Trizol提取真菌RNA的方法 DNA提取笔记 点 这里 查看sci文章润色服务 点 这里 领我们整理的软件库 点 这里 看R界传奇老司机直播录像 点 这里 进免费免安装的文献下载神器 Freescience联盟QQ交流群: 463367325 |
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