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质粒构建:从入门到精通之初窥门径

2018-06-22  风雨都停了

来源:科研小助手公众号

编者按
很多人的科研生涯中都会绕不开质粒构建这个坎,那么质粒如何而来呢?前人遗留?实验室没人做过这个基因怎么办?公司购买?周期长、成本高还不一定靠谱怎么破?找相关文章作者索取?耗时费力却不一定得到回音如何是好?


正所谓自己动手丰衣足食!所以还是自己构建吧!啥?不会!没关系,本文正合适啥都不会的实验小白!嗯?我已经会了!没关系,相信你读完本文之后也会受益良多的!(Note:因本系列文章主要面向实验小白,所以写的非常详细,已经掌握所述技能的可以略过)好了,小编就不在废话了,让我们简单粗暴的直接进入主题吧!


读完本文您将获得以下技能

0. 学会获取目的基因的CDS序列;
1. 学会设计引物;
2. 掌握Primer Premier 5的使用方法;
3. 懂得如何选择以及在引物上添加酶切位点;
4. 获取cDNA的多种渠道;
5. 初步掌握质粒构建的技能;
6.
获得快速构建质粒的高逼格技能


引物设计

通常我们要通过PCR获取目的基因片段,所以质粒构建第一步就是设计引物。首先大体了解一下引物设计的一些通用原则:


1. 引物长度一般在15~30 bp,最常用的是18~27bp;

2. 引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好在72℃左右。Tm值简单粗暴的计算方法为Tm=4×(G+C)+2×(A+T),或在此基础上减5℃;

3. 引物3’端不能选择A,最好选择T,G/C的错配率介于A/T之间;

4. 以上为最主要的原则,另外还要注意引物的特异性、引物内部不能形成二级结构等原则,具体可以百度之;


当然以上原则并不一定非要完全符合,但是作为一个新手而言初期最好是严格遵守为妙。下面就以构建人源PD1(PDCD1)为例为大家讲解。


CDS的获取

要设计引物自然要知道这个基因的CDS序列了。获取一个基因CDS序列的方法如下:
打开NCBI(
https://www.ncbi.nlm.nih.gov),如下图,按照顺序,在1处选择Nucleotide,在2处输入“PDCD1”,点击3处的Search,等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选(如果你要做鼠源的就选Mus musculus,其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了




然后第一条就是我们需要的序列信息,点击进去,往下拉,直到看到CDS(如下图)



点击CDS,就出现了下图中所示内容,其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了,可以看到这段序列开头是ATG起始密码子,最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。


还可以点击右下角的FASTA得到下图所示内容,这边也可以方便的复制目的基因的CDS序列。


由于需要PCR整个CDS区域,所以正反向引物并没有多少选择的余地,甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物,例如:



正向引物序列与CDS相同,反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向,一般不会从3’到5’,所以我们的CDS虽然没有注明方向,但是其实也是5’到3’。


虽然可以这么简单粗暴的设计引物,但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。


Primer 5的使用

如下图,首先点击File->New->DNA Sequence,



然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列,选择As is,即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。


下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”



点击左上角的Primer,如下图,S=Sense,A=Antisense



如果对现在的引物不满意,还可以点击Edit Primers编辑序列,如下图,我们删除掉末尾三个碱基,之后需要先点击Analyse,然后才能点击OK,我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。


最后点击Edit->Copy->Sense Primer,粘贴到Word中即可得到正向引物,反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便,Primer 5还有很多强大的功能,你可以自行探索,也可以加小编微信(amateur_1988)拉入官方微信群交流。


这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因,现在的引物就可以送去合成了,但是如果你想将其构建到载体上,那么我们还要对其进行进一步的加工。


Primer 5的使用

根据不同的目的,可以选择不同的载体,如过表达(pcDNA 3.0)、敲减(pLKO.1-TRC)、原核纯化(pGEX-4T1、pET-28a)、病毒包装(pMSCV-puro)、敲除(lentiCRISPR v2)等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。


从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择,那是不是每个位点都可以用呢?当然不是!我们要选择那些PDCD1(或其他目的基因)本身没有的酶切位点!


所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。


还是打开Primer 5,然后粘贴CDS序列,点击Enzyme,2为所有的酶,我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶,双击即可到3的框中,选好之后点击OK,可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点,所以这两个不可以选,其他的都可以选。



不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI,那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。


于是我们得到如下引物:


好了,我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。


质粒构建

终于到正题了!

待引物合成之后,我们用ddH2O将其稀释到100 μM作为母液,取一些稀释到10 μM做下一步实验了。

首先我们P出目的基因,这一步建议用高保真PCR酶,小编常用的是Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶。反应体系及反应条件如下图:




模板的获取

1. 找到表达(最好高表达)该基因的细胞或者组织,用TRIzol法抽提RNA,然后用反转录试剂盒得到相应的cDNA作为模板;


2. 免费索取。给大家推荐一个可以免费索取cDNA的地址:http://hanlab.xmu.edu.cn。韩家淮院士为大家免费提供cDNA,只需要进入该网址点击左侧导航栏的cDNA索取”即可免费获取韩家淮院士实验室的cDNA了!


PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段,也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切,同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶,还可以打开网址http://t.cn/RVuwBVo查询双酶切所用的最佳Buffer。




酶切回收之后的片段进行连接,小编使用的是Thermo公司的T4连接酶,体系如下:




现在的T4连接酶基本都是快酶,比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成,不过小编保险起见,一般连接30 min,切勿连接过夜!

连接完成之后便是转化,挑菌(单克隆),摇菌抽提质粒,送去测序就OK了!

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