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http://www./bbs/thread-31348-1-1.html 螺旋网上的关于NCBI的一些视频教程
（DNA/cDNA/mRNA/promoter/primer/protein/SNP查找,BLAST使用 最新更新关于SNP的若干问题) 最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST进行序列比对……，这些问题在NCBI上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下BCBI的使用。希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！
我分以下几个部分说一下NCBI的使用： Part one： 如何查找基因序列、mRNA、Promoter （第一页） Part two ：如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列（第一页） Part three ：运用STS查找已经公布的引物序列（第二页） Part four： 如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性（第三页） Part Five：5.1 从SNP的序列号入手找到其对应的基因序列和该SNP在基因组中的具体位置。5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位点（第四页） 如果您感觉网页形式看起来太乱，请到 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9681760&sty=1&tpg=2&age=0 下载PDF版本（此PDF版本为我实验室的lzfist所整理，包含前四部分内容） 特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！ 从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！ 请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充。 First of all，还是让我们从查找基因序列开始。 Part one: 利用Map viewer查找基因序列、mRNA序列、启动子（Promoter）[同一个页面即可显示基因序列和启动子] 下面以人的IL6（白细胞介素6）为例讲述一下具体的操作步骤 一、打开Map viewer页面，网址为：http://www.ncbi.nlm./mapview/index.html 在search的下拉菜单里选择物种，for后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示：  二、点击“GO”出现如下页面：
 三、在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图： 说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列，这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。  四、点击上述三条序列第一条序列（即reference）对应的"Genes seq"，出现新的页面，页面下方为：
 五、点击上图出现的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下载查看序列等功能，结果如图所示：  先对上面这张图做点简要的说明，在Sequence Format（序列输出格式）后面是一个下拉式选择菜单，默认的为FASTA格式，还有一个是GenBank格式。我推荐大家选择GenBnak格式，因为这个格式提供了很多该基因的信息，而FASTA格式只有基因序列。
六、在Sequence Format后选择GenBank，然后点击下面的Display，目的基因的相关信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示（网页较大，只抓取一小部分以作示范）：  在上述打开的网页中，你可以看到基因长度，基因序列，以及这个基因是如何被报道出来的等各种信息。
你会看到: mRNA join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..8394) 这代表了从基因的3598位开始就是转录区了，即我们常说的mRNA片断，由于内含子的存在，所以mRNA在DNA序列上分成了几段。 CDS join(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..7970) CDS代表编码序列，即蛋白编码区是从3660开始的（ATG），由于剪接作用所以CDS区也是不连续的。 说到这里，可能很多朋友都已经明白了promoter即启动子区域在哪里了。但我还是再唠叨几句：转录起始位点前面是基因的调控区，启动子区没有明显的位置定义，大家也只是猜测它的大体位置，如果你要研究promoter区的话，建议你选择转录起始位点前的2000个碱基进行研究，一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话，也可以只研究-1000到0这一千个碱基，因为一般情况下，启动子区的变异都在这个区域内。 这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了，这种方法可能使用的人不是很多，但我个人比较喜欢，因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。希望大家可以发帖交流，让我们把NCBI用的更好！ NCBI的使用：Part two 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人类的IL6为例） 1、进入NCBI主页：http://www.ncbi.nlm./ 在search后面选择Gene，在for后面填写需要查找的基因的名字。如图所示：  点击“Go”，出现以下界面：
 出现了很多基因序列，在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接，这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是别名（Other Aliases）与你的目的基因一致，根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的IL6是标号为2的序列。
2.1、查找cDNA序列 2.1.1、点击Order cDNA clone, 出现目的页面如图所示：  2.1.2、点击Clone Sequence后面的链接即可得到cDNA序列。点击后如图所示（只抓取其中一部分）：
 2.2、查找mRNA、蛋白序列
回到步骤1点击“Go”之后出现的页面，点击目的基因的名字，出现以下页面(只抓取相关部分)：  页面的下半部分，即可以获取mRNA和蛋白序列的部分：
 找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分为几个板块，第一个“mRNA and Protein
 ”区可以让我们找到连续的编码mRNA序列和蛋白序列。在mRNA and Protein下面有两个序列代码（中间划有一个箭头），这代表了mRNA序列和蛋白序列。分别点击就可以得到相应的序列页面。点击后如图所示，mRNA序列：  蛋白序列如下：
NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二个板块是Reference assembly，它下面显示的是Genomic ，点击Genomic下面Reference assembly对应的Genbank或FASTA即可出现编码的DNA序列（注意：只是编码序列，其中包括内含子，但一般没有5‘非编码区）。这一步就不做贴图演示了吧，呵呵。
这样我们就可以找到基因的cDNA序列、连续的编码mRNA序列、蛋白序列以及含有内含子的编码DNA序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。
如果大家有更好的方法，欢迎发帖交流！ 友情提示：在NCBI里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能会有令我们惊喜的收获！ 最后唠叨一句：最近我实验比较忙，只能在深夜发帖，可能要过几天再发第三部分[Part three 运用STS查找已经公布的引物序列]，希望“期待下集”的朋友可以理解。 STS，序列标签位点（Sequence Tagged Site）：一段短的DNA序列（200－500个碱基对），这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR反应中可以检测处STS来，STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。 以上内容基本是STS的定义，我主张活学活用，下面就介绍一下我个人用STS数据库查找引物的一点经验。 一步一步教你使用NCBI之三： Part three 运用STS查找已经公布的引物序列 还是使用人的IL6基因为例，呵呵 一、打开NCBI主页，在Search后面的下拉菜单选择UniSTS，在FOR后面填写目的基因。 操作完毕如图所示： 点击GO以后出现以下页面，
 这是你会发现NCBI又提供了很多序列，下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。
二、根据物种、目的阴物所在染色体的位置等选择相应序列（可能不只一个），点击。 下面以点击第一个进入的画面为例。  你会发现这个页面直接就给出了引物序列，PCR之后的片段长度也是给了的（247bp）。下面还有很多相关的信息…… 三、点击GeneBank Accession 后面的代码，进入下一个页面。 啊！前后引物都呈现在眼前了，还有反应体系和反应条件！其中Primer A是前引物序列，Primer B则是后引物序列，并且给出了他们在DNA序列中的位置。有兴趣的朋友可以在序列中找一下，是可以找到的， 不过要注意，PCR是双链扩增，在序列中可以直接找到的是Primer A的原序列 和 Primer B的互补序列。
在步骤二里面我只点开了一个序列，继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物，不过这要你自己慢慢发掘了。 这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道，实用程度不是很高，但如果这里面恰好有你想P的片段的话，恭喜你，这些引物都是很成熟的引物，可以直接拿过来使用了。 如果想寻找引物，大家可以查阅相关论文，已经报道的引物我们为什么不用呢？！既省时间，可靠性又强。 如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话，那就自己设计吧，建议使用Primer 5 和 Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了，推荐两个帖子给大家看一下，第一个是本版版主liuzeyi2002发起的，内容很丰富，很值得学习，另一个则是我发的。 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=0 Part four 如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性 将于下周与大家见面…… 夜色很深了，我也该睡觉了，祝大家实验顺利，每天都能做个好梦！ Part four 如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性 提到序列比对，绝大多数战友都会想到BLAST，但BLAST的使用确实又是一个很大的难题，因为他的功能比较强悍，里面涉及到的知识比较多，而且比对结束后输出的结果参数（指标）又很多。如果把BLAST的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得BLAST的使用。所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST的使用，也算是BLAST的入门课程吧。请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后BLAST的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了。 一、打开BLAST页面，http://www.ncbi.nlm./BLAST/ 打开后如图所示：  对上面这个页面进行一下必要的介绍：
BLAST的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是BLAST的三条途径。 第一部分BLAST Assembled Genomes就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。 第二部分Basic BLAST包含了5个常用的BLAST，每一个都附有简短的介绍。 第三部分Specialized BLAST是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP等等，这个时候你就需要在Specialized BLAST部分做出适当的选择了。 总之，这是一个导航页面，它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST途径。 下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST的使用，期间我也会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。
二、点击Basic BLAST部分的nucleotide blast链接到一个新的页面。打开后如图所示： 介绍一下上述页面：
Enter Query Sequence部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列）。Job Title部分还可以为本次工作命一个名字。 Choose Search Set部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类（genome DNA、mRNA等等）。如果是人或老鼠的话，就可以直接选择了如果是其他物种就要选择“others”了，这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框，你可以分别选择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。下面的Entrez Query可以对比对结果进行适当的限制。 Program Selection部分其实是让我们选择本次比对的精确度，种内种间等等。 在BLAST按钮下面有一个“Algorithm parameters” ，这是参数设置选项，一般用户使用不到此项，所以它比较隐蔽，点击，原网页下方即可增加了Algorithm parameters的内容。大部分战友都用不到更改这里面的选项，我也不多说了，有兴趣的朋友可以自己研究一下。 三、依次填写上述网页必须部分，点击BLAST按钮后，出现如下界面（只截取其中一部分）：
 出现的这个结果页面信息含量非常大，如果我们用心观察，还是可以发现其中的一些主要指标的。列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。其中Description部分推荐大家详细看一下，另外说一下“E value” 这个指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。
在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了，还配合着各种参数的得分。 好了，各位亲爱的战友，我的BLAST就发到这里为止了，更具体的东西有待大家一起去努力研究。伴随着BLAST的终结，我的“一步一步教你使用NCBI”也要暂时告一段落了，很高兴自己发第一个帖子时说的话今天终于做到了。以后如果我有新的NCBI使用方法的话，我还会添加到这里来，但我想这一阵子是不会接着发了，呵呵。
真心希望各位战友在这里一起交流自己使用NCBI的一些技巧，正如丁香园的宗旨一样——“我为人人，人人为我”，让我们互相学习、共同进步，最后再一次祝愿大家试验顺利！ yh9913 wrote: 对于以上yh9913战友的提问，尽我所能回复如下： 1、根据你的实验目的，我个人认为你应该比对的是你设计的siRNA序列（现在再比对原mRNA好像没有什么价值了吧）。 2、输入跟要降解的RNA配对的那条链简单直接一点，可以直接选择只BLAST RNA。（其实，如果你有耐心，输入siRNA的正义还是反义链都是一样的，NCBI都会列举出有可能跟他配对的所有序列，不管正义还是反义链，你的理想结果不都是跟某一特定的RNA结合效能较高吗？你输入两条链的任何一条，NCBI都会列出与其配对的RNA、DNA and so on，你可以找到与你输入序列配对的DNA看一下，主要看结合位置，需要耐心噢）。但要注意输入的顺序一定要是5‘到3‘。 3、我没有做过RNAi，所以对AMBION也没有了解。但我个人认为他设计出来的这些siRNA序列应该也有自己的评价标准吧，建议先选举AMBION认为较好的序列再使用BLAST比对。 4、关于BLAST是否可以多个序列同时比对的问题我也不是很清楚，我听说可以，但至今我也不知道怎么才能做到。希望知情的战友回帖指导。 Bonnie03 wrote: 以下内容作为这一系列帖子的第五部分： Part Five: 5.1 从SNP的序列号入手找到其对应的基因序列和该SNP在基因组中的具体位置。5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位点 5.1 从SNP的序列号入手找到其对应的基因序列和该SNP在基因组中的具体位置。 跟Bonnie03 PM之后，得到rs号为rs6677188，其实这不是一个基因的编号，而是一个SNP的编号。要得到它的详细信息可以参考以下途径，有兴趣的战友可以自己照着做一下，为了节约版面，不做详细抓图： 1，打开NCBI的SNP页面，网址为 http://www.ncbi.nlm./sites/entrez?db=Snp 在搜索的for后面填写rs编号，点击go 2，这时会出现搜索结果页面，如图所示： 由于编号是唯一的，所以搜索结果也是唯一的，如果要得到它的详细信息，点击该编号对应的超链接即可。
3，点击该编号对应的超链接，得到详细信息页面，如图所示（抓取部分页面）：  4.1 如果要得到该SNP所在基因的序列，可通过点击NCBI Resource Links对应的序列代码实现，建议选择GenBank(即NT 032977)，这里不做演示，有兴趣的朋友可以自己操作。
4.2 如果要得到该SNP在基因组里的位置图，可以通过点击Integrated Maps对应的超链接（即chromosome1）来实现，点击后出现下图： 如果你看过这个帖子前几部分的内容，对这张图一定不陌生了，呵呵
5，要得到这个SNP在基因组中详细的位置，点击Map element下面对应的超链接就可以了，这里就不抓图演示了，建议选择第一个，即reference所对应的。 以上内容都是建立在查找文献后，知道了一个既定的位点后而进行的。 5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位点 如果要查找一个基因所有已公布的SNP信息，可以直接打开SNP主页，在搜索框里填写目的基因名字，然后搜索，下面的问题就不复杂了，相信大家可以自己实现，我就不多说了。 关于SNP暂时先说这么多，关于何如使用NCBI查找SNP方面的信息，欢迎大家发帖交流，我自己也是做SNP方面的试验，也希望这面的知识能够知道更多，期待大家指导…… |
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