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一步一步教你使用NCBI(挺不错的,推荐)

2011-03-02  fandy0718
 螺旋网上的关于NCBI的一些视频教程
 

(DNA/cDNA/mRNA/promoter/primer/protein/SNP查找,BLAST使用 最新更新关于SNP的若干问题)
 
最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST进行序列比对……,这些问题在NCBI上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历(经验)跟大家交流一下BCBI的使用。希望大家都能发表自己的使用心得,让我们共同进步!
我分以下几个部分说一下NCBI的使用:
Part one: 如何查找基因序列、mRNA、Promoter (第一页)
Part two :如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列(第一页)
Part three :运用STS查找已经公布的引物序列(第二页)
Part four: 如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性(第三页)
Part Five:5.1 从SNP的序列号入手找到其对应的基因序列和该SNP在基因组中的具体位置。5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位点(第四页)


如果您感觉网页形式看起来太乱,请到 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9681760&sty=1&tpg=2&age=0 下载PDF版本(此PDF版本为我实验室的lzfist所整理,包含前四部分内容)

特别感谢本版版主,将这个帖子置顶!
从发帖到现在,很多战友对该帖给与了积极的关注,在此向给我投票的(以及想给我投票却暂时不能投票的)各位战友表示真诚的感谢,谢谢各位战友!
请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充。


First of all,还是让我们从查找基因序列开始。

Part one: 利用Map viewer查找基因序列、mRNA序列、启动子(Promoter)[同一个页面即可显示基因序列和启动子]

下面以人的IL6(白细胞介素6)为例讲述一下具体的操作步骤
一、打开Map viewer页面,网址为:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html
在search的下拉菜单里选择物种,for后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示:


二、点击“GO”出现如下页面:

三、在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框,在Gene前面的小方框里打勾,然后点击Filter. 出现下图:
说明一下:1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了三个,是不同的部门做出来的,经我验证,序列有微小的差异,但总体来说基本相同。尽管你分别点击后,序列代码、序列代码等有所差异,但碱基基本一致,不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列,这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。

四、点击上述三条序列第一条序列(即reference)对应的"Genes seq",出现新的页面,页面下方为:


五、点击上图出现的“Download/View Sequence/Evidence ”,即下载查看序列等功能,结果如图所示:
 
先对上面这张图做点简要的说明,在Sequence Format(序列输出格式)后面是一个下拉式选择菜单,默认的为FASTA格式,还有一个是GenBank格式。我推荐大家选择GenBnak格式,因为这个格式提供了很多该基因的信息,而FASTA格式只有基因序列。
六、在Sequence Format后选择GenBank,然后点击下面的Display,目的基因的相关信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示(网页较大,只抓取一小部分以作示范):
 
在上述打开的网页中,你可以看到基因长度,基因序列,以及这个基因是如何被报道出来的等各种信息。
你会看到: mRNA join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..8394) 这代表了从基因的3598位开始就是转录区了,即我们常说的mRNA片断,由于内含子的存在,所以mRNA在DNA序列上分成了几段。
CDS join(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..7970)
CDS代表编码序列,即蛋白编码区是从3660开始的(ATG),由于剪接作用所以CDS区也是不连续的。

说到这里,可能很多朋友都已经明白了promoter即启动子区域在哪里了。但我还是再唠叨几句:转录起始位点前面是基因的调控区,启动子区没有明显的位置定义,大家也只是猜测它的大体位置,如果你要研究promoter区的话,建议你选择转录起始位点前的2000个碱基进行研究,一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话,也可以只研究-1000到0这一千个碱基,因为一般情况下,启动子区的变异都在这个区域内。

这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了,这种方法可能使用的人不是很多,但我个人比较喜欢,因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。希望大家可以发帖交流,让我们把NCBI用的更好!


NCBI的使用Part two 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列(依然以人类的IL6为例)

1、进入NCBI主页:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
在search后面选择Gene,在for后面填写需要查找的基因的名字。如图所示:
 
点击“Go”,出现以下界面:
出现了很多基因序列,在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接,这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的,有些是别名(Other Aliases)与你的目的基因一致,根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的IL6是标号为2的序列。
2.1、查找cDNA序列
2.1.1、点击Order cDNA clone, 出现目的页面如图所示:
2.1.2、点击Clone Sequence后面的链接即可得到cDNA序列。点击后如图所示(只抓取其中一部分):
2.2、查找mRNA、蛋白序列
回到步骤1点击“Go”之后出现的页面,点击目的基因的名字,出现以下页面(只抓取相关部分):
 
页面的下半部分,即可以获取mRNA和蛋白序列的部分:
找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”,它分为几个板块,第一个“mRNA and ProteinMoon”区可以让我们找到连续的编码mRNA序列和蛋白序列。在mRNA and ProteinMoon下面有两个序列代码(中间划有一个箭头),这代表了mRNA序列和蛋白序列。分别点击就可以得到相应的序列页面。点击后如图所示,mRNA序列:

蛋白序列如下:


NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二个板块是Reference assembly,它下面显示的是Genomic ,点击Genomic下面Reference assembly对应的Genbank或FASTA即可出现编码的DNA序列(注意:只是编码序列,其中包括内含子,但一般没有5‘非编码区)。这一步就不做贴图演示了吧,呵呵。

这样我们就可以找到基因的cDNA序列、连续的编码mRNA序列、蛋白序列以及含有内含子的编码DNA序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。

如果大家有更好的方法,欢迎发帖交流!


友情提示:在NCBI里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息,大家不妨好好看看,可能会有令我们惊喜的收获!

最后唠叨一句:最近我实验比较忙,只能在深夜发帖,可能要过几天再发第三部分[Part three 运用STS查找已经公布的引物序列],希望“期待下集”的朋友可以理解。


STS,序列标签位点(Sequence Tagged Site):一段短的DNA序列(200-500个碱基对),这种序列在染色体上只出现一次,其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR反应中可以检测处STS来,STS适宜于作为人类基因组的一种地标,据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。

以上内容基本是STS的定义,我主张活学活用,下面就介绍一下我个人用STS数据库查找引物的一点经验。

一步一步教你使用NCBI之三:
Part three 运用STS查找已经公布的引物序列

还是使用人的IL6基因为例,呵呵

一、打开NCBI主页,在Search后面的下拉菜单选择UniSTS,在FOR后面填写目的基因。
操作完毕如图所示:
 
点击GO以后出现以下页面,
这是你会发现NCBI又提供了很多序列,下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。
二、根据物种、目的阴物所在染色体的位置等选择相应序列(可能不只一个),点击。
下面以点击第一个进入的画面为例。

你会发现这个页面直接就给出了引物序列,PCR之后的片段长度也是给了的(247bp)。下面还有很多相关的信息……
三、点击GeneBank Accession 后面的代码,进入下一个页面。
 
啊!前后引物都呈现在眼前了,还有反应体系和反应条件!其中Primer A是前引物序列,Primer B则是后引物序列,并且给出了他们在DNA序列中的位置。有兴趣的朋友可以在序列中找一下,是可以找到的, 不过要注意,PCR是双链扩增,在序列中可以直接找到的是Primer A的原序列 和 Primer B的互补序列。

在步骤二里面我只点开了一个序列,继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物,不过这要你自己慢慢发掘了。

这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道,实用程度不是很高,但如果这里面恰好有你想P的片段的话,恭喜你,这些引物都是很成熟的引物,可以直接拿过来使用了。

如果想寻找引物,大家可以查阅相关论文,已经报道的引物我们为什么不用呢?!既省时间,可靠性又强。

如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话,那就自己设计吧,建议使用Primer 5 和 Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了,推荐两个帖子给大家看一下,第一个是本版版主liuzeyi2002发起的,内容很丰富,很值得学习,另一个则是我发的。
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=0

Part four 如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性 将于下周与大家见面……

夜色很深了,我也该睡觉了,祝大家实验顺利,每天都能做个好梦!


Part four 如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性

提到序列比对,绝大多数战友都会想到BLAST,但BLAST的使用确实又是一个很大的难题,因为他的功能比较强悍,里面涉及到的知识比较多,而且比对结束后输出的结果参数(指标)又很多。如果把BLAST的使用详细的都讲出来,我想我发帖发到明天也发不完,更何况我自己也不是完全懂得BLAST的使用。所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST的使用,也算是BLAST的入门课程吧。请看帖的战友好好体会,如果你用心看,在看帖完毕之后BLAST的基本使用(包括其他序列的比对)应该没有问题了。

一、打开BLAST页面,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 打开后如图所示:
对上面这个页面进行一下必要的介绍:

BLAST的这个页面主体部分(左面)包括了三部分:BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思,我就不多说了;我要说的是,可以认为这是三种序列比对的方法,或者说是BLAST的三条途径。

第一部分BLAST Assembled Genomes就是让你选择你要比对的物种,点击相应物种之后即可进入比对页面。

第二部分Basic BLAST包含了5个常用的BLAST,每一个都附有简短的介绍。

第三部分Specialized BLAST是一些特殊目的的BLAST,如IgBLAST、SNP等等,这个时候你就需要在Specialized BLAST部分做出适当的选择了。

总之,这是一个导航页面,它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST途径。
下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST的使用,期间我也会含沙射影的说一下其他序列比对的方法。

二、点击Basic BLAST部分的nucleotide blast链接到一个新的页面。打开后如图所示:
介绍一下上述页面:

Enter Query Sequence部分是让我们输入序列的,你可以直接把序列粘贴进去,也可以上传序列,还可以选择你要比对的序列的范围(留空就代表要比对你要输入的整个序列)。Job Title部分还可以为本次工作命一个名字。

Choose Search Set部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类(genome DNA、mRNA等等)。如果是人或老鼠的话,就可以直接选择了如果是其他物种就要选择“others”了,这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框,你可以分别选择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。下面的Entrez Query可以对比对结果进行适当的限制。

Program Selection部分其实是让我们选择本次比对的精确度,种内种间等等。

在BLAST按钮下面有一个“Algorithm parameters” ,这是参数设置选项,一般用户使用不到此项,所以它比较隐蔽,点击,原网页下方即可增加了Algorithm parameters的内容。大部分战友都用不到更改这里面的选项,我也不多说了,有兴趣的朋友可以自己研究一下。
三、依次填写上述网页必须部分,点击BLAST按钮后,出现如下界面(只截取其中一部分):


出现的这个结果页面信息含量非常大,如果我们用心观察,还是可以发现其中的一些主要指标的。列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。其中Description部分推荐大家详细看一下,另外说一下“E value” 这个指标与其他指标不同,它的数值越小相似程度越高,其他几个(如Totle score)都是数值越高相似度越高。

在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了,还配合着各种参数的得分。

好了,各位亲爱的战友,我的BLAST就发到这里为止了,更具体的东西有待大家一起去努力研究。伴随着BLAST的终结,我的“一步一步教你使用NCBI”也要暂时告一段落了,很高兴自己发第一个帖子时说的话今天终于做到了。以后如果我有新的NCBI使用方法的话,我还会添加到这里来,但我想这一阵子是不会接着发了,呵呵。

真心希望各位战友在这里一起交流自己使用NCBI的一些技巧,正如丁香园的宗旨一样——“我为人人,人人为我”,让我们互相学习、共同进步,最后再一次祝愿大家试验顺利!


yh9913 wrote:
楼主,我现在正在研究RNAi.通过对你1-3集的学习,我顺利的找到了我要的mRNA序列,也设计了siRNA序列,然后就一直苦等你的第四集BLAST.但我从昨天你发贴开始看,到现在也还没学会怎么比对序列的同原性.Sad楼主没有举例啊,所以看得很抽象.有问题请教:

urbest 说:
Enter Query Sequence部分是让我们输入序列的,你可以直接把序列粘贴进去,也可以上传序列,还可以选择你要比对的序列的范围(留空就代表要比对你要输入的整个序列)。Job Title部分还可以为本次工作命一个名字。

请问,我要输入的是整个mRNA序列,还是设计的siRNA序列?如果是输入siRNA序列,是正义还是反义链的序列?方向是5'-3'还是3'-5'?那Query subrange 的"FROM ...TO ..."里该填什么内容呢?
我用AMBION的设计软件,出来很多siRNA序列,在用BLAST比对同源性时,是不是只能一个序列一个序列的去检测啊?那工作量就超大了啊!!!

本人很是愚钝,急盼楼主和各位高手指点迷津!!谢谢了.....

对于以上yh9913战友的提问,尽我所能回复如下:
1、根据你的实验目的,我个人认为你应该比对的是你设计的siRNA序列(现在再比对原mRNA好像没有什么价值了吧)。
2、输入跟要降解的RNA配对的那条链简单直接一点,可以直接选择只BLAST RNA。(其实,如果你有耐心,输入siRNA的正义还是反义链都是一样的,NCBI都会列举出有可能跟他配对的所有序列,不管正义还是反义链,你的理想结果不都是跟某一特定的RNA结合效能较高吗?你输入两条链的任何一条,NCBI都会列出与其配对的RNA、DNA and so on,你可以找到与你输入序列配对的DNA看一下,主要看结合位置,需要耐心噢)。但要注意输入的顺序一定要是5‘到3‘。
3、我没有做过RNAi,所以对AMBION也没有了解。但我个人认为他设计出来的这些siRNA序列应该也有自己的评价标准吧,建议先选举AMBION认为较好的序列再使用BLAST比对。
4、关于BLAST是否可以多个序列同时比对的问题我也不是很清楚,我听说可以,但至今我也不知道怎么才能做到。希望知情的战友回帖指导。
Bonnie03 wrote:
请问urbest楼主,直到一个基因的rs号,如何确定它在整个基因组中的genome location?


以下内容作为这一系列帖子的第五部分:

Part Five: 5.1 从SNP的序列号入手找到其对应的基因序列和该SNP在基因组中的具体位置。5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位点

5.1 从SNP的序列号入手找到其对应的基因序列和该SNP在基因组中的具体位置。

跟Bonnie03 PM之后,得到rs号为rs6677188,其实这不是一个基因的编号,而是一个SNP的编号。要得到它的详细信息可以参考以下途径,有兴趣的战友可以自己照着做一下,为了节约版面,不做详细抓图:
1,打开NCBI的SNP页面,网址为 在搜索的for后面填写rs编号,点击go
2,这时会出现搜索结果页面,如图所示:
由于编号是唯一的,所以搜索结果也是唯一的,如果要得到它的详细信息,点击该编号对应的超链接即可。
3,点击该编号对应的超链接,得到详细信息页面,如图所示(抓取部分页面):
4.1 如果要得到该SNP所在基因的序列,可通过点击NCBI Resource Links对应的序列代码实现,建议选择GenBank(即NT 032977),这里不做演示,有兴趣的朋友可以自己操作。
4.2 如果要得到该SNP在基因组里的位置图,可以通过点击Integrated Maps对应的超链接(即chromosome1)来实现,点击后出现下图:


如果你看过这个帖子前几部分的内容,对这张图一定不陌生了,呵呵

5,要得到这个SNP在基因组中详细的位置,点击Map element下面对应的超链接就可以了,这里就不抓图演示了,建议选择第一个,即reference所对应的。

以上内容都是建立在查找文献后,知道了一个既定的位点后而进行的。

5.2 查找目的基因的所有已公布SNP位点

如果要查找一个基因所有已公布的SNP信息,可以直接打开SNP主页,在搜索框里填写目的基因名字,然后搜索,下面的问题就不复杂了,相信大家可以自己实现,我就不多说了。


关于SNP暂时先说这么多,关于何如使用NCBI查找SNP方面的信息,欢迎大家发帖交流,我自己也是做SNP方面的试验,也希望这面的知识能够知道更多,期待大家指导……






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