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作为分子实验狗，我相信，每一个做过分子克隆的人，都有过对条带、菌落和测序结果望穿秋水的时刻，毕竟有些时候克隆实验是限速步骤。在这个过程中，人品是很重要滴，但是乜，大家也应该随时随地对克隆保持警惕，一旦出现问题立刻进行反思、改正。如果重复几次还没看到你心心念念梦寐以求的结果，请一定记得回头，仔细核查实验的各个环节，不要怀揣着侥幸心理哦！ OK，下面让我们一起，把上次未填完的坑继续填平吧！ 转化后，长出了很多克隆，鉴定后发现没有目的片段插入 1. 载体没有处理好。如果载体通过PCR扩增得到，扩增产物可能残留大量环状质粒模板，可选择胶回收纯化，降低污染。如果载体通过酶切得到，可能残留大量未切开质粒，增加酶量、延长酶切时间和酶切后切胶回收，都可以有效减少甚至消除环状质粒的残留； 2. 反应体系被具有相同抗性的质粒or杂菌污染。 转化后，长出了很多克隆，但测序后发现插入片段不正确 1. 首先，确保测序结果的准确性。一般来说，测序结果的头尾两端可信程度较低，存在一定的错误率，中间600~800bp的片段可靠性较高，如果心存疑虑可以换一家公司重新检测； 2. 扩增目的片段时确保引物设计无误； 3. 确保扩增后目的片段大小正确，且为单一条带。如果出现非特异性条带，建议优化PCR体系提高特异性，重新扩增后胶回收纯化，得到正确的目的片段； 4. 目的片段切胶回收时，在紫外灯下不能暴露过长时间，UV照射会引起较高的突变率； 5. 如果线性化载体不是由空载体酶切或扩增制备，而是由已插入其他不同片段的载体酶切或扩增制备得到的话，不完全酶切或残留环状模板质粒将导致很高的转化背景，使部分克隆中含有不正确插入片段。提高酶切效率、使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效避免此类情况发生； 6. 插入的目的片段序列过大时，建议选择转化效率较高的感受态细胞。前一篇我们说过了，有些时候可能你的克隆已经连接成功，然而一旦选择了活性差的感受态细胞，则很有可能功亏一篑（再度安利我们的高效感受态，性价比高，物美价廉，活力都是杠杠的）。 7. 最后的最后，如果上述都救不了你的克隆的时候，只能采取最最最最最原始的方法：鉴定更多的菌落。也就是说，多挑几（十）个菌落，多做几（十）次PCR鉴定，然后送去测序。有些克隆本身连接的成功率较低，长出的菌落数目也较少，在这种情况下，只能通过挨个菌落PCR鉴定来找到对的克隆。 挑取菌落，PCR鉴定呈阳性，但是测序显示是空载体 上述这种情况，不知大家是否遇到过？小编倒是遭遇过几次，总是怀疑测序公司有误，然鹅换一家测序，结果还是一样的，一脸懵逼.jpg。 那么这种情况是咋么产生的乜？菌落PCR的假阳性高，关键在于做连接的时候加了较多目的基因的酶切产物。转化时，未连接上的目的片段，有的会沾在感受态细胞上，有的在溶液中，涂板时一起涂在板上了，挑菌的时候把平板上没转进去的片段也挑到了，当然，没有转进菌的载体也在平板上。所以，我们PCR扩增出的假阳性率，其实是很高的，PCR只是一个初步的筛选。 So，我们应该怎么办呢？ 1. 可挑菌落溶在10或者20 ul水中，新平板上划线，观察生长情况，如果生长则进行鉴定，阳性送去测序； 2. 用载体引物和目的片段引物一起扩增，不能只用目的片段/载体引物。即，用一个载体上的引物（如通用引物T7等），再用一个目的片段上的引物进行扩增； 3. 挑菌落摇小管，抽提质粒进行PCR鉴定，当然，双酶切验证更为可靠。酶切后电泳，应把重组质粒同酶切的产物一起点样，如果重组质粒的大小等于酶切后两条带的大小，说明重组成功； 4. 此外，也可以多做几个双酶切或三酶切，每组中至少有一个酶是插入片段上的，电泳跑胶，从而确保目的片段插入到载体中。 话说分子实验，本来就很tricky的！所以啊，小伙伴们，还有很长滴路要走滴，还有很多滴泪要慢慢流滴，还有无数次失败滴实验结果让你坚信当年选了这一行是脑子进了水滴，anyway，分子克隆的一系列坑今天暂时填平了，希望小伙伴们的科研生活就像今天的封面DNA图一样，七彩斑斓，色彩缤纷（我在胡说些什么？实验室怎么可能会有这样的生活？除非是大肠杆菌入脑了。。。。）OK，下次，我们再见啦！n(*≧▽≦*)n |
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