【原】质粒构建原理及步骤

质粒构建原理

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒构建方式

质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。

质粒载体制备

质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

步骤

01 PCR扩增

首先要对目标片段进行扩增富集。PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。其特点是能将微量的 DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。

简要步骤：利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制 PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微瞬离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。

02 酶切连接

获得目标片段后，要交到载体中，必须借助两个工具来实现——酶切工具（限制性内切酶）和连接工具（DNA 连接酶）。

简要步骤：配制琼脂糖凝胶（常用浓度 1-2%）后点样，切胶电泳回收目的片段，选择合适的内切酶将目的片段和质粒载体同时切割，酶切后的片段再次电泳回收，测定浓度后按比例加入 T4 DNA 连接酶，粘性末端载体、目的片段、缓冲液，进行连接后直接转化。