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分子克隆 最强攻略  注意！！敲重点！！ 小编为你呕心沥血整理了超多干货 以下可能是史上最全、最基础的 分子克隆知识     分子克隆是一个实验室最基础、也是最重要的实验技术，照例先介绍原理 !  基本原理 分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。也就是用体外重组的方法将目的基因插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化或转导的方式，引入适合的受体细胞内，使目的基因得到复制与扩增，然后再从筛选后的受体细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增，并使宿主细胞获得新的遗传特征。 还是一脸懵逼？我们可以先了解传统的分子克隆技术，下面的流程示意图可以帮助你在脑海中形成一个初步的印象。 传统分子克隆基本流程  孔子曰：“敏而好学，不耻下问”。 老实说，上面的好多内容我都不懂…… 没关系，那我们就从最基础的各种名词开始，为大家一一详解！ 知识小点 PCR 分子克隆的第一步一般为PCR，以获得大量的可供连入载体的目的基因。PCR反应的基本成分包括：模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，具体步骤就在此省略。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有杂带的需要切胶回收目的片段。 详情可查看： 您可能会用到： 插入DNA片段 就是你想要克隆的DNA片段，也被称为插入片段（Insert）。它可以来自原核细胞或真核细胞，可以是基因组 DNA、另一质粒的一部分或线性 DNA 片段、实验室中人工合成的DNA片段，或者是从mRNA反转录产生的cDNA。 无论来源类型如何，制备插入DNA片段时常用的第一个步骤是进行限制性内切酶酶切，产生匹配的粘性末端，以便接下来将片段插入载体中。 载体 载体（Vector）是能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。载体一般是质粒，也可以是噬菌体。 可以作为克隆载体的条件: ● 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞； ● 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖； ● 具有由单一限制酶识别的位点组成的多克隆位点(MCS)； ● 具有用于选择克隆子的标记基因，例如抗生素耐受。如果宿主整合了质粒，它将可以在含有抗生素的培养基中存活，这样允许我们选择已经成功转化了的细胞。 ● 克隆载体必须是安全的，不能含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入受体细胞外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。 您可能会用到： 在此小编额外为大家介绍几个小小小小的基础知识点： 限制性酶切位点 Restriction Enzyme cutting site DNA上一段碱基的特定序列，DNA限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA序列切成两段。限制性内切酶位点外一般需要有保护碱基。 多克隆位点 Multiple Cloning Site, MCS 是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。 在一些载体中，MCS 位于标记基因内，可筛选已经成功拼接进插入DNA片段的克隆子。例如后面会讲到的蓝白筛选。  宿主细胞 宿主细胞也叫受体细胞，指在转化或转导中接受外源基因的细胞。进行基因工程的宿主细胞一般为限制酶缺陷型，便于后续的克隆筛选。宿主细胞有原核受体细胞、真核受体细胞(最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞（其实也是真核细胞）。原核受体细胞中,最常用的宿主细胞是大肠杆菌，它生长迅速，可广泛获得不同克隆载体。 一般可根据插入DNA片段的类型选择最佳载体及宿主细胞。 以下视频详细介绍了质粒载体的制备， 还有中英文双语对照哦~ How to perform plasmid prep  双酶切 分子克隆中通常将插入DNA片段和载体进行双酶切，即选择一种内切酶同时切割插入DNA片段和载体 DNA，以生成连接所需的互补末端 ，由于载体和插入DNA片段末端之间的兼容匹配性，二者仅可沿一个方向连接，因而这种方法可实现目的DNA片段的插入。进行双酶切时，同时提供两种酶所需最优的反应缓冲液和反应条件至关重要。因此，为确保酶切成功，应严格遵守供应商提供的双酶切反应建议。 您可能会用到： 连接 连接(Ligation)是插入DNA片段和载体连接成为重组质粒的过程，需要DNA连接酶，最常用的就是T4 DNA连接酶，可连接DNA末端的 5′磷酸基和 3′羟基。连接反应通常还需要ATP、DTT 和镁离子等成分，为了提高连接效率可优化反应条件。 您可能会用到： 点击链接观看视频，视频对连接的步骤进行了非常详细的介绍哦~ 感受态细胞 感受态细胞（Competent cell）：通过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是使细胞的通透性变大，便于外源基因或载体进入感受态细胞。一般可使用CaCl2法或电转法处理受体细胞制备感受态细胞，或直接进行购买。 您可能会用到： 转化 转化（Transformation）是受体细胞直接摄取供体细胞的DNA片段而获得新的遗传性状的过程。一般情况下质粒载体的转化效率很低，因此需要先制备感受态细胞。可根据下游应用的不同选择不同的感受态细胞。一般的转化步骤为将连接体系加到感受态细胞中冰上孵育，然后42°C下热激活，再至于冰上。处理后，部分质粒DNA会被受体细胞吸收，并在体内开始复制。亦可采用电转化的方法，使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 具体的转化相关介绍请点击以下视频： How to perform transformation 转化后即可在平板上接种细胞进行培养，点击下方链接观看视频查看详细步骤： 克隆筛选 接下来我们以最常用的蓝白筛选为例介绍克隆筛选，由于蓝白筛选使用T载体进行，因此不需要做双酶切。平板上最终产生的蓝、白菌落中，白色菌落为我们要的目的菌落。蓝白斑筛选是一种分子克隆中常用的克隆筛选方法。 蓝白筛选原理 野生型大肠杆菌可以产生β-半乳糖苷酶，可以将无色的化合物X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和蓝色物质，使菌落呈现蓝色。也就是说在X-gal底物的平板中可以生长且菌落呈蓝色的是能产生β-半乳糖苷酶的菌落。 适用于蓝白筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主细菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因发生突变，导致其编码的β-半乳糖苷酶失去一个α肽段，从而不具有生物活性，及无法产生完整的β-半乳糖苷酶。未转入质粒载体的受体细胞单独培养只能产生白色菌落。 您可能会用到： 一般的蓝白筛选都会和抗性筛选结合使用，抗性筛选可确定受体细胞是否吸收质粒载体。如选择带有抗生素基因标记的载体，不含载体的细菌不带有抗性基因，无法在含有抗生素的平板上生长；经过转化含有载体的细菌（不管是否含有插入DNA片段）都可表达抗生素耐受基因，因而可以在含有抗生素的平板上生长。 您可能会用到： 用于蓝白筛选的载体上具有β-半乳糖苷酶启动子和编码α肽段的基因，编码α肽段的基因区段中包含一个多克隆位点（MCS），但其本身不影响载体编码的α肽链的活性。当该载体被转入宿主细胞中后，载体产生的α肽链与宿主细胞产生的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有完整酶的活性，即可将X-gal底物分解产生蓝色物质，这种现象叫α互补。也就是说转入细胞的载体的多克隆位点上没有插入DNA片段时，该菌落呈现蓝色。 实验中通常添加IPTG激活载体中的启动子，携带空载体的细胞呈蓝色，插入DNA片段与外源基因连接后，重组质粒载体不表达α肽链，因此不能分解底物产生蓝色物质，培养表型呈现白色菌落。但是未转入质粒载体的细菌，由于不能形成完整的β-半乳糖苷酶，菌落也呈现白色。 蓝白筛选步骤 具体了解蓝白筛选步骤可点击上方视频哦 Blue-White cloning 如果你还没有阅读尽兴， |
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来自： stingray928 > 《生物》
