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专题1 基因工程 1.2 基因工程的基本操作程序
1、什么是目的基因？
是指基因工程操作中所需要的外源基因，主要是指编码蛋白质的结构基因。
如：抗逆性基因、调控基因等
2、什么是基因文库？
⑴、概念：指储存着某种生物不同基因的受体菌群。
⑵、特点：分别储存着某种生物的不同基因。
⑶、获得方法：将含有某种生物不同基因的DNA片段导入受体菌群中。
⑷、基因组文库：含有某种生物全部基因的基因文库。
⑸、部分基因文库：含有某种生物部分基因的基因文库。
cDNA文库：指利用mRNA通过反转录获得的互补DNA片断。
⑹、构建基因文库的目的和作用：
目的：为获取大量的目的基因做准备；
作用：大量储备同种基因。
3、基因、基因文库、目的基因之间有什么区别？
⑴、基因：是有遗传效应的DNA片段，是控制生物形状遗传的遗传物质的功能的基本单位。
⑵、基因文库：是储存着某种生物不同基因的受体菌群。
⑶、目的基因：基因工程操作中所需要的外源基因。
4、原核细胞、真核细胞基因结构有什么不同？
⑴、不同点：
①、原核细胞基因结构简单，无内含子，编码区连续。
②、真核细胞基因结构复杂，有内含子，编码区不连续。
⑵、相同点：
①、基因结构中都有编码区、非编码区；
②、非编码区都有调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列；
③、编码区上游都有RNA酶结合位点（启动子）。
5、从基因文库中获取目的基因的依据是什么？
⑴、基因的脱氧核苷酸序列
⑵、基因的功能
⑶、基因在染色体上的位置
⑷、基因的转录产物——mRNA
⑸、基因的表达产物——蛋白质
6、什么是PCR技术？
⑴、概念：PCR技术，就是聚合酶链式反应技术，就是在生物体外大量复制特定DNA片断。
⑵、条件：已知所需要复制DNA（基因）的脱氧核苷酸序列。
⑶、过程：热解旋，获得DNA单链（以作模板），单链与引物结合，DNA聚合酶催化，四种游离脱氧核苷酸
作原料，形成子代DNA。
⑷、增长方式：指数增长：2n。
7、人工合成法：
适用于：脱氧核苷酸序列已知、片段较小的基因。
8、DNA复制、PCR技术与基因克隆比较
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DNA复制 |
PCR技术 |
基因克隆 |
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场所 |
细胞核 |
生物体外 |
细胞内 |
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酶 |
解旋酶、DNA聚合酶 |
Taq酶 |
限制酶、连接酶 |
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载体 |
不需要 |
不需要 |
需要 |
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遵循原则 |
碱基互补配对 |
碱基互补配对 |
碱基互补配对 |
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结果 |
DNA分子 |
DNA分子片段 |
DNA分子片段 |
9、怎样构建基因表达载体？
⑴、用一定的限制酶切割质粒，使之出现一个黏性末端切口。
⑵、用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端。
⑶、将目的基因片段插入质粒切口，加入适量DNA连接酶，使目的基因与质粒形成重组质粒。
⑷、基因表达载体的构成：
目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因
10、什么是启动子？
⑴、位置：位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
⑵、结构：特殊DNA片段
⑶、作用：启动基因的转录
11、什么是终止子？
⑴、位置：位于基因尾端
⑵、结构：特殊DNA片段
⑶、作用：终止基因的转录
12、什么是转化？
⑴、转化是指目的基因进入受体细胞内并维持稳定和表达的过程。
⑵、转化的实质：目的基因融合到受体细胞染色体基因组中。
13、受体细胞的种类：
⑴、微生物：细菌细胞
⑵、植物细胞：卵细胞、受精卵、体细胞
⑶、动物细胞：受精卵、胚胎细胞
14、有哪些导入目的基因的方法？
⑴、微生物：感受态细胞法
①、感受态细胞：指细菌细胞经过Ca2+处理后，细胞壁透性增强，能够吸收周围环境中DNA分子
的生理状态。
②、过程：Ca2+处理细胞 → 感受态细胞 → 表达载体与感受态细胞混合 → 感受态细胞吸收DNA分子。
⑵、植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
①、农杆菌：土壤微生物，易感染双子叶植物和裸子植物；
对大多数单子叶植物没有感染力。
②、Ti质粒的T_DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。
③、过程：目的基因插入T_DNA，T_DNA进入农杆菌，将农杆菌导入植物细胞。
⑶、动物细胞：显微注射法
操作程序：
①、目的基因表达载体经过提纯备用，取得受体动物的卵（或受精卵）备用。
②、采用显微注射技术将目的基因表达载体注射到卵（或受精卵）中。
③、培养液培养成为早期胚胎。
④、将早期胚胎移植到雌性动物子宫内，发育成新个体。
15、怎样检测和鉴定目的基因？
⑴、检测：
①、导入检测：检测受体细胞染色体DNA上是否含有目的基因。
DNA分子杂交法（DNA探针法）。
②、表达检测：检测目的基因是否完成转录出mRNA。
分子杂交法检测RNA。
检测目的基因是否完成表达翻译成蛋白质。
提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交。
⑵、鉴定：个体生物学水平鉴定，鉴定抗性等。
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