| 镍钛合金作为一种常用的医学材料,被用于整形科和心血管科等多个方面,如用于人造骨骼和牙齿、心血管支架等,但由于镍钛合金中含有约54.5%-56.3%的可能会致畸致癌的镍元素,因此对镍钛合金和镍离子的生物相容性研究非常必要。目前对镍离子的生物相容性研究已经在整体水平、细胞水平和分子水平上开展,但在分子水平的研究中大部分仍采用RT-PCR、ELISA等传统的分子生物学方法对少量DNA、蛋白质、代谢物等进行分析,也有少量使用高通量的组学技术(如基因表达谱芯片技术、液质联用技术等)对单一分子层次整体水平进行的研究,而将多种组学技术相结合以从系统生物学的角度探讨镍离子的细胞毒性机理则未见报道。本论文的目的是首先采用蛋白质组学和代谢组学技术结合生物信息学方法分别在蛋白质水平和代谢水平上研究镍离子的细胞毒性机理；再与本课题组前期已完成的基因组学结果进行联合分析,从多层次生物组学的系统生物学的角度阐述镍离子的细胞毒性机理。本论文的主要内容如下：1.蛋白质组学和代谢组学实验：以正常的完全培养基培养L929细胞作为对照组,使用含不同浓度镍离子的培养基培养L929细胞不同时间作为实验组,然后使用胰酶或裂解液收集细胞样品(包括对照组和实验组),并寄送至公司进行蛋白质组学实验和代谢组学实验。2.蛋白质组学结果的生物信息学分析：统计各实验组中蛋白质差异表达情况,在100μM的12h、24h和48h组中分别检测到了158、1633、1587个差异表达蛋白质,在200μM的12h、24h和48h组中分别检测到了66、1292、1784个差异表达蛋白质,在6个实验组中共得到了22种共有的差异表达蛋白质,其中19个为功能性蛋白质。使用DAVID和GenMAPP分别对各实验组的差异表达蛋白质进行GO(基因本体论)分析和生物学通路分析,6个实验组中均有多个GO功能类别受到了镍离子影响,其中镍离子浓度为200μM、作用时间为48h时L929细胞内受影响的GO功能类别最多；6个实验组中均有蛋白质发生差异表达的生物学通路共有16条,有多条通路与细胞的粘附与迁移、细胞生长与增殖、细胞内基因和蛋白质的表达、能量代谢、炎症反应等相关,这与前期得到的基因组学结果有相似之处。3.蛋白质组学结果的验证：采用Western blot实验对蛋白质组学结果进行了验证,选取的五个蛋白质在Western blot和蛋白质组学中的表达模式完全一致,证明了基于iTRAQ技术的蛋白质组学结果的可靠：采用ATP能量代谢检测实验对蛋白质组学分析结果中镍离子会对细胞内的能量代谢过程产生影响这一结论进行了验证,结果表明随着镍离子作用浓度提高和作用时间增强,细胞内ATP含量显著下降,镍离子的确会影响细胞内能量代谢过程。4.代谢组学结果的分析：使用多种多元统计学分析方法对代谢组学的原始数据进行了分析并筛选,在100μM的12h、24h和48h组中分别检测到了40、64、79种差异表达代谢物,在200μM的12h、24h和48h组中分别检测到了41、77、64种差异表达代谢物。使用MetaboAnalyst在线软件对各个实验组的差异表达代谢物进行了代谢通路分析,在6个实验组中全部出现的代谢通路仅有3条：苯丙氨酸代谢通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路(氨基酸代谢类)、氮素代谢通路(能量代谢类),表明了镍离子对细胞内蛋白质合成与代谢以及能量代谢过程产生了很大的影响。5.三种组学结果的联合分析：将基因组学、蛋白质组学和代谢组学三个层次上的通路分析结果进行了对比,筛选到在三个水平上均受镍离子影响的三条通路：谷胱甘肽代谢通路、TCA循环通路和不饱和脂肪酸的生物合成通路,因此镍离子通过影响细胞中氨基酸、碳水化合物、脂质这三种主要物质的代谢过程,进一步从蛋白质的合成、能量代谢、细胞膜稳定性等多个方面对细胞产生影响。6.蛋白质组学结果和代谢组学结果的联合分析：将蛋白质组学和代谢组学结果进行了联合分析,发现19条与氨基酸代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢等相关的生物学通路中在两个层次上均受到了镍离子的影响,从多个方面揭示了镍离子的毒性机制。 |
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