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编译：阿温，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 线粒体的显著特征是具有高度动态性和调节性，在细胞代谢、生物合成、衰老、凋亡和信号转导途径中发挥重要作用。线粒体功能障碍可能导致多种严重疾病，包括癌症。因此，识别癌症中的线粒体蛋白可以提供肿瘤发生和进展的全局观点。基于质谱的定量线粒体蛋白质组学是通过对线粒体蛋白质丰度和线粒体蛋白质翻译后修饰(PTMs)进行系统范围的、准确的定量分析来完成这项任务。多个定量蛋白质组学技术可以提高研究人员研究线粒体蛋白质组的灵活性，这些技术包括同位素编码亲和标签、细胞培养中氨基酸标记的稳定同位素、相对和绝对定量等标签、串联质量标签和label‐free定量，结合不同的PTM肽段富集方法，如磷酸化肽段的TiO2富集方法和其他肽段的抗体富集方法。本文概述了线粒体的分离和纯化，定量线粒体蛋白质组学，定量线粒体磷酸化蛋白质组学，线粒体蛋白质参与的信号通路网络，线粒体磷酸化蛋白质参与的信号通路网络，整合卵巢癌(OC)的线粒体蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据与整个组织的蛋白质组和转录组数据及临床信息，以深入了解其分子机制和发现有效的线粒体生物标志物和治疗靶点，预测、预防和个性化治疗OC。这种OC线粒体蛋白质组学的原理证明模型很容易应用于其他类型的癌症。 论文ID 内容 1. 前言 A.线粒体蛋白质组学的重要性 线粒体是真核细胞中高度特化的细胞器，具有重要的生物学功能。线粒体功能障碍与许多疾病有关，包括癌症、糖尿病、衰老、肌肉营养不良、帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。在过去的几十年里，研究为各种癌症中线粒体功能的改变提供了新的前沿，以识别线粒体相关的信号通路，从而深入了解线粒体在肿瘤发生中的机制，确定用于诊断和预后评估的生物标志物，并发现有效治疗的治疗靶点。除了细胞核(细胞的chomosomal DNA)，线粒体是唯一含有独立线粒体DNA (mtDNA)的细胞器。mtDNA编码37个基因，包括2个核糖体RNA (rRNAs)， 13个线粒体肽亚基和22个转运RNA。大量证据表明mtDNA对肿瘤进展易感性和肿瘤微环境中细胞功能的影响。线粒体有外膜、内膜、膜间空间和基质四种结构间隔。多种重要的生物过程(BPs)发生在线粒体的不同区域，包括氨基酸代谢、丙酮酸氧化、细胞死亡敏感性、脂肪酸氧化、Krebs循环、线粒体活性氧(mtROS)的产生、类固醇代谢、信号转导和三磷酸腺苷(ATP)的产生。之前的一项基于质谱(MS)的线粒体蛋白组学研究使用了体内pull-down酶联标记的方法分离了人类线粒体亚区，发现了495个定位在线粒体基质中的蛋白质。 癌症中线粒体蛋白及其翻译后修饰(PTMs)的鉴定可能为了解是什么导致癌细胞失控提供有价值的信息。自1998年首次用MS分析人类胎盘线粒体蛋白质组以来，亚细胞蛋白质组学包括线粒体蛋白质组学已经取得了很大的成就。目前对mossPhyscomitrella患者的线粒体蛋白质组学研究提醒人们要发展线粒体蛋白质组学，从系统的角度了解蛋白质库存、修饰和功能改变的进化差异。概述线粒体蛋白质组学的现状将有助于了解线粒体蛋白质组的作用，准确评估线粒体蛋白谱，线粒体蛋白相关信号通路网络，发现诊断和治疗生物标志物，并探索线粒体癌的分子机制。 B. 人类卵巢癌(OCs)的定量线粒体蛋白质组学的病理生理学基础 妇科癌症起源于卵巢、阴道、子宫颈和子宫。OC是一种常见的致命性癌症，全球女性死亡率最高。其主要危险因素包括年龄较大、基因突变、家族史、化学物质(苯)、生育史、节育、不孕或生育治疗、子宫内膜异位症、乳腺癌(阳性BRCA1或BRCA2基因)和肥胖。OC的确切分子机制尚不清楚。许多检查已经被开发用来帮助诊断OC，包括血液测试(碳水化合物抗原125)，成像测试(超声波、计算机体层摄影或磁共振成像)、腹腔镜、结肠镜检查、腹部液体抽吸和活组织检查。然而，提高OCs的早期诊断率仍有非常重要的临床意义，因为OC患者的预后取决于他们的早期诊断，有助于5年总生存率提高94%。因此，发现新的肿瘤生物标志物以提高OC的早期诊断率。 既往研究表明，线粒体功能障碍与OC密切相关。线粒体负责mtDNA突变、能量代谢、氧化应激、细胞凋亡、动力学、线粒体-细胞核互动、钙超载、耐药性、自噬和免疫过程(图1)。扫描电镜观察到OC细胞胞浆内线粒体形态的改变，线粒体松散，有虫蛀的外观。此外，失调的线粒体动力学在OC中发挥关键作用，例如，改变线粒体裂变动力学影响上皮OC细胞亚群的表型。此外，线粒体在OC中是多功能的细胞器，包括能量代谢、氧化应激、细胞凋亡、细胞周期、线粒体自噬、耐药性、免疫过程，以及在肿瘤微环境中与其他细胞器互动或代谢灵活性。特别是，一些线粒体蛋白已被报道为治疗靶点，用于抑制OC中的线粒体相关通路，如Bcl‐2、p53和galectin‐3，可见线粒体功能障碍与OC发病机制的关系。然而，分子机制、新的早期诊断生物标志物和新的治疗靶点仍然有限，有必要发展基于MS的线粒体蛋白质组学(比较线粒体蛋白质组学及其PTMs)，以有效管理人类OCs。 图1 线粒体在卵巢癌中的重要作用 一种基本观点认为，OC起源于正常卵巢，线粒体在卵巢癌发生中起重要作用。因此，定量线粒体蛋白质组的变化将阐明OC中任何线粒体介导的病理生理变化。多种定量蛋白质组学方法已被开发用于分离线粒体、定量线粒体蛋白质和定量线粒体磷酸化蛋白，包括细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)、同位素编码亲和标记(ICAT)，等压标签的相对和绝对定量(iTRAQ)、串联质量标签(TMT)和label-free法(图2)。 图2 基于质谱的线粒体蛋白质组学策略在人类卵巢癌中的应用 本文将总结人类OC中基于MS的线粒体蛋白质组学，包括定量线粒体蛋白质组学的再现性，线粒体蛋白质组的定量的参考图，人类OC与对照组织线粒体蛋白组的差异，线粒体磷酸化蛋白质组，线粒体多组学数据的综合分析(线粒体蛋白质组学数据、整个组织的蛋白质组学数据和转录组数据)，分子网络变化，蛋白质相互作用网络、生物标志物和治疗靶点。此外，仅监测线粒体蛋白质组成的改变是不够的；鉴定它们的PTMs和线粒体蛋白形态是必要的。线粒体多组学数据的整合将极大地促进OC的研究。此外，参与鉴定线粒体蛋白的相互作用网络和分子通路可为OC的系统生物学研究提供基础。 2. 线粒体蛋白质组学方法 A.OCs线粒体样本的制备 高纯度的线粒体样品是线粒体蛋白质组学分析的关键问题。许多方法被用于从细胞或组织中分离和纯化线粒体样本，包括自由流动电泳、试剂盒方法、差速离心、使用蔗糖、Nycodenz、Percoll™或甲泛葡胺的密度梯度离心。就分离的线粒体的浓度、活性和污染而言，在实际应用中，每种线粒体分离方法都有其优缺点。利用pH梯度样品注射的循环自由流动等电聚焦技术从兔肝中分离线粒体。膜电位测量和蛋白质组学分析显示，循环自由流动等电聚焦是制备完整线粒体的有效方法，提供了高度纯化的线粒体。然而，由于特殊设备的限制和低产量，自由流动电泳技术在线粒体蛋白质组学研究中面临挑战。试剂盒方法产生的线粒体蛋白浓度较高，操作简单、快速，然而提取线粒体的工具很昂贵。差速离心往往导致分离的线粒体纯度较低，有必要优化实验条件。密度梯度离心在高产量、高纯度和功能线粒体方面具有巨大的优势。差速离心和不连续渗透密度的密度梯度离心相结合，已成功地用于从大鼠前脑和大脑中制备线粒体样本，这种方法非常适合从小组织样本中分离线粒体。因此，联合方法是可靠的，以获得高纯度的线粒体组分，用于线粒体蛋白质组研究。 几个研究小组已经使用不同的方法从OC细胞和组织中分离出线粒体样本。对于OC细胞模型，Dai等人率先在铂敏感OC细胞(SKOV3和A2780)和铂耐药OC细胞(SKOV3/CDDP, SKOV3/CBP, A2780/CDDP,A2780/CBP)之间进行了直接的线粒体蛋白质组比较。Chen等人在Dai等人的基础上改进了线粒体分离程序，即他们使用重复差速离心和不连续密度梯度离心从OC细胞中获得高质量的线粒体部分。简单地说，6个细胞系(SKOV3、A2780、SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP、A2780/CBP)离心(800g, 5分钟, 4℃)，洗涤(冰‐冷磷酸盐缓冲盐[PBS])三次。细胞颗粒重悬于10容量匀浆缓冲液(70 mM蔗糖、0.5 mM乙二醇双(2‐氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、1.5 mM MgCl2、210 mM甘露醇、10 mM氯化钾(KCl)、1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制剂、50 mM Tris‐HCl、pH7.4)中，并用玻璃脉冲均化器均化。将OC细胞匀浆离心(1000 g, 10 min, 4℃)，匀浆缓冲液洗涤2次。将上清液离心(10000 g, 3次, 4℃)，收集粗线粒体片段。通过密度梯度离心(52000g, 90 min, 4℃)与Nycodenz联合对线粒体样本进行纯化，包括5个从底部到顶部的Nycodenz密度梯度34%、30%、25%、23%、20% v/v (5/8/12/8/3 mL)。离心后，在25-30%部分得到线粒体片段。用5体积匀浆缓冲液稀释线粒体部分，离心(15000 g, 20 min,4℃)后获得纯化的线粒体制备品。对于人类OC组织模型，Zhan等人首次在相对于对照组织(常见良性妇科疾病)的上皮OC组织中鉴定了线粒体表达蛋白(mtEPs)。线粒体分离缓冲液含100 mM KCl, 70 mM蔗糖，210 mM甘露醇，1 mM EDTA, 0.1 mMEGTA, 1 mM苯甲磺酰氟蛋白酶抑制剂，2 mM原钒酸钠(V)， 50 mM Tris‐HCl, 0.2%牛血清白蛋白，pH 7.4。将1.5 g上皮OC组织完全切碎成1 立方毫米的片，用含0.2 mg/mL Nagarse的13.5 mL线粒体分离缓冲液匀浆(2 min, 4℃)。下面的从OC细胞中制备线粒体的过程与上述步骤相似。然而，用上述方法很难从对照卵巢组织中分离出良好的线粒体。若要制备对照卵巢组织线粒体，需对上述方案进行修改：对照卵巢组织需在8 mL缓冲液(PBS溶液中加入0.05%胰蛋白酶/20 mM EDTA)中充分切碎，消化(30 min, 室温)，然后匀浆。使用Nycodenz分为六个密度梯度，在一个管中从下到上梯度为38%，34%，30%，25%，23%和20% v/v(8/5/8/12/8/3 mL)，得到的线粒体在梯度25-30%到梯度34-38%之间。另一种方案与OC组织的方案相同。 一些研究人员还使用商业线粒体分离试剂盒(Thermo FisherScientific, Rockford, IL)从OC细胞(A2780‐和A2780‐CP20)分离和纯化线粒体。Thermo Fisher Scientific用于培养的细胞的线粒体分离试剂盒(线粒体分离试剂A、B和C)能够从胞质组分中分离完整的线粒体。线粒体分离试剂盒是一种使用商业试剂一次处理多个样品的独特方案，并依靠差速离心机分离线粒体和使用台式微离心机分离细胞质组分。2×107个细胞被离心(850g, 2 min, 4℃)。用线粒体分离试剂A重悬细胞微球，并用冰孵育2 min，再加入10 μL线粒体分离试剂B，静置冷冻孵育5 min。加入800 μL线粒体分离试剂C体积，离心(700g, 10min, 4℃)，上清再离心(12000g, 5min, 4℃)。再将500 μL的线粒体分离试剂C加入沉淀物中，离心(12000 g, 5 min)，丢弃上清以获得线粒体片段。 B. 分析方法 基于质谱的线粒体蛋白质组学由于其灵敏度和速度，已广泛应用于线粒体蛋白质组的大规模鉴定和定量。例如，mtDNA表达的维持对细胞内稳态很重要，基于MS的线粒体蛋白质组学已用于分析应激诱导的人类线粒体蛋白质的变化，以显示线粒体转录拯救因子1，可防止线粒体转录本丢失，在细胞处于应激状态时升高。基于二维液相色谱(2DLC)串联质谱分析(MS/MS)检测成年大鼠抑郁模型中线粒体蛋白质组学，发现丙咪嗪治疗后九个线粒体蛋白质(mtDEPs)差异表达，表明线粒体可能在治疗人类疾病中是一个至关重要的药物治疗靶点。液相色谱常与质谱联用，为多维蛋白鉴定技术(MudPIT)提供了重要发展。为了增加肽的数量和肽分离的能力，MudPIT集成了强阳离子交换(SCX)预分选和反相高效液相分离。MudPIT采用序列蛋白水解和多重提取的方法来增加肽的鉴定，它规避了许多问题，包括强疏水性肽、PTMs、极端等电点和跨膜蛋白质聚集的倾向。基于质谱的线粒体蛋白质组学可以通过label-free和稳定同位素标记策略来定量蛋白质。 基于MS的label-free定量蛋白质组学是基于质谱信号强度或肽谱计数。样品制备简单，不需要昂贵的同位素标记。几乎所有种类的蛋白质都可以用基于MS的label-free蛋白质组学分离和识别。当研究大的和全局的蛋白质时，相对定量信息可以同时比较多个生物样本。然而，对液相色谱分离和label-free质谱/质谱鉴定的稳定性和再现性的要求是严格的，需要充分的技术重复来验证结果的可靠性。每个样品单独分析，导致低通量。此外，与稳定同位素标记策略相比，有许多因素影响label-free定量蛋白质组学的重现性和准确性。一些研究人员已经使用优化的label-free定量蛋白质组学来分析组织特异性线粒体蛋白质组。例如，label-free定量蛋白质组学在线粒体蛋白质组分析中得到了优化和改进，包括使用多种酶消化过滤辅助样品制备方案，而不是使用单一蛋白酶的标准过滤辅助样品制备方案，从而提高了序列的覆盖率，显著提高了蛋白质的鉴定总数。FreeQuant的开发结合了无标签定量和功能分析，以充分利用MS为基础的蛋白质组学。新策略在准确评价异构体丰度和有效完成复杂蛋白的功能分析方面具有很大的优势。FreeQuant定量分析方法在人心脏、小鼠心脏和小鼠肝脏线粒体蛋白质组的分析中表现出较好的性能和可用性。 以稳定同位素标记为基础的线粒体蛋白质组学主要包括ICAT、SILAC、iTRAQ或TMT，外加基质辅助激光解吸/电离飞行时间‐MS (MALDI-TOF-MS)或者LC-MS/MS。不同样品中的蛋白质用含氨基酸残基的化学等效微分质量标签进行标记，并通过稳定同位素标记策略进行定量比较分析。这些方法，如ICAT、SILAC、iTRAQ或TMT，各有优缺点。ICAT可以通过比较含半胱氨酸肽的同位素谱的LC-MS峰面积来量化最多两个样品。ICAT可以简化复杂的胰酶肽段混合物，只标记含半胱氨酸的肽。然而，没有半胱氨酸的蛋白质和多肽不能用这种方法定量，并且在ICAT技术中会丢失一些PTMs位点。iTRAQ是一种高通量、短周期技术，可使用多路等压标记试剂对2-8个样品进行标记。定量信息是通过比较4个MS/MS报告离子(m/z, 114至117)或8个MS/MS报告离子(m/z, 113-119和121)的强度来获得的。然而，iTRAQ的局限性在于，随着样本数量的增加，量化信息会逐渐减少，系统误差会逐步增加。与基于SILAC标签的定量相比，iTRAQ在定量信息的丰度和准确性方面相对较低。TMT方法类似于iTRAQ方法。SILAC在细胞培养中标注氨基酸，最多可以比较两到三个样本。细胞在相同条件下培养，培养基中含有重链同位素氨基酸(如L‐精氨酸[13C6, 15N4]和L‐赖氨酸[13C6, 15N2])或轻链同位素氨基酸。因此，细胞中新合成的蛋白质经过5 ~ 6代培养后被同位素标记，酶解后，用质谱将轻链标记和重链标记的肽段清晰区分，进行定量分析。在样品制备和处理过程中，以SILAC为基础的定量方法最不容易受到样品间电位变化的影响，从而有助于减少系统误差，提高定量精度。此外，这种多路复用策略增加了MS通量。然而，SILAC仅适用于细胞培养样品，以限制其在癌症组织中基于MS的线粒体蛋白质组学中的应用。 Label-free定量蛋白质组学和大多数同位素标记定量蛋白质组学都有潜在的局限性，如样品制备的复杂性、增加的时间、有限的线性动态范围和增加的质谱复杂性。此外，同位素标记策略也受到标记试剂昂贵的影响。在这里，我们总结了不同的稳定同位素标记方法和label-free策略的优缺点(表1)。 表1 几种定量蛋白质组学技术的优缺点 几个研究团队已经使用不同的基于质谱的线粒体蛋白质组学方法来研究人类OCs的线粒体蛋白质组。Dai等人、Chappell等人和Chen等人对人类OC细胞铂耐药细胞(SKOV3/CBP、SKOV3/CDDP、A2780/CDDP和A2780/CBP)，顺铂 (CDDP)耐药细胞(A2780‐CP20)和紫杉醇耐药细胞(SKOV3‐TR和A2780‐TR)中分别进行了线粒体蛋白质组学研究。对于人类OC细胞及其铂耐药细胞的线粒体蛋白质组学，在凝胶电泳中使用2‐DE和2D差异(DIGE)来分离和量化线粒体蛋白。对于DIGE，每个线粒体蛋白样品在缓冲液(7 M尿素，40 mM Tris, 4% w/v CHAPS, 2 M硫脲，pH 8.0)中使用Cy3或Cy5染料进行标记。将每个样品等量混合，用Cy2染料(内标)标记。每个来自人类OC细胞系的线粒体蛋白样本，包括化疗敏感细胞(SKOV3和A2780)和化疗耐药细胞系(SKOV3/CBP、SKOV3/CDDP、A2780/CDDP和A2780 /CBP)分别用2‐DE凝胶分离。利用DeCyder v.5.0软件对2‐DE凝胶的荧光图像进行定量和统计，获取相对蛋白水平。感兴趣的蛋白点从2‐DE凝胶中切割下来，用胰蛋白酶进行消化，用MALDI‐MS对纯化的胰酶肽段进行鉴定。但也要考虑到基于2D凝胶的方法的局限性，如线粒体疏水性蛋白检测困难，动态范围有限，以及任何具有极端分子量和pI值的蛋白。因此，LC-MS可以表征和量化OC细胞及其CDDP耐药细胞的线粒体蛋白。胰酶肽段用nanoflow LC (Easy‐nLC)耦合LTQ‐Orbitrap Velos MS (Thermo Fisher Scientific)进行分析。用于人类OC细胞及其紫杉醇耐药细胞的线粒体蛋白质组学研究，一种LC杂交线性离子阱傅里叶变换离子回旋共振(FT‐ICR)质谱也用于表征和量化线粒体蛋白。在这种方法中，赖氨酸残基的e-氨基被胍化以阻止多个标签的加入。实验组用2H6‐乙酸酐标记SKOV3‐TR和A2780‐TR细胞的线粒体蛋白，对照组用1H6‐乙酸酐标记SKOV3和A2780细胞的线粒体蛋白。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些细胞系(SKOV3、A2780、SKOV3‐TR和A2780‐TR)的线粒体蛋白悬液。通过检查MALDI‐MS光谱，可以对用不同同位素标记的肽段进行相对定量。近期，Zhan等人对人类OC与对照卵巢组织进行了iTRAQ定量线粒体蛋白组学研究。在这种方法中，上皮细胞OC和对照组织线粒体蛋白的肽段用6‐plex iTRAQ试剂标记。标记的肽段混合物经过SCX预分馏，然后LC‐MS/MS分析鉴定了5115个mtep。 综上所述，线粒体蛋白质组学的分离和定量方法各不相同，各有优缺点。根据实验设计和目的，在给定的线粒体蛋白质组分析中推荐一种组合的、优化的多方法策略。 3. 人类OCs线粒体蛋白质组的概况 A. 定量线粒体蛋白质组学在人类OCs中的重现性 最大重现性是准确量化线粒体蛋白质组的首要前提，涉及到整个实验过程，包括线粒体的制备、线粒体蛋白质的提取、胰蛋白酶消化、iTRAQ‐标记、SCX‐分离、LC‐MS/MS分析以及数据库搜索和定量计算。首先，需要获得高质量的线粒体样本。我们的研究发现OC与对照组的卵巢组织制备线粒体的方法差异如上所述。在我们优化的实验方案下，采用差速离心和密度梯度离心相结合的方式制备了高质量的线粒体样品。电镜(EM)分析表明，制备的线粒体样品除少量过氧化物酶体外，主要细胞器为OCs和对照卵巢内的线粒体；与对照卵巢相比，外周卵巢的线粒体形态变化更明显。Western blot (WB)分析表明，在制备的线粒体样品中，除了少量过氧化物酶体外，主要成分为线粒体。WB结果与EM结果一致。在制备的线粒体中含有过氧化物酶体是合理的，因为线粒体与过氧化物酶体有广泛的相互作用，反映线粒体功能的完整性。这些结果表明制备的线粒体样品质量高。第二，获得足够数量的线粒体蛋白样本。一般来说，iTRAQ定量蛋白质组学至少需要600 μg蛋白质(每次iTRAQ标记200 μg蛋白质，三次重复)。我们的研究结合了分别从7个OC组织和11个对照卵巢组织制备的线粒体样本。我们的研究分别结合了7个OC组织和11个对照卵巢组织制备的线粒体样本，从OC组织中共获得2409 μg线粒体蛋白，从对照组卵巢组织中共获得4440 μg线粒体蛋白，这些量对于iTRAQ定量蛋白质组学分析是足够的。第三，应该通过iTRAQ定量蛋白质组学来达到定量蛋白的最大数量，以便对人类OC中线粒体进行深入研究。与对照组卵巢组织的线粒体相比，我们的研究检测、鉴定和量化了来自OC组织的线粒体样本中的5115个蛋白质，包括2,565(50.14%)上调蛋白(癌与对照比率>1)和2,550(49.86%)下调蛋白(癌与对照比率< 1)。第四，变异系数(CV)，相关系数(r)和定量5115个蛋白质的fold‐change进行了计算，以反映基于iTRAQ的线粒体定量蛋白质组学的重现性(表2)。99.10%蛋白质的CV <30%，5115个蛋白的平均CV为6.53% (CV范围，0-75%)。它们的平均r为0.94(范围为0.93-0.96)，其中99.24% (n = 5,076)蛋白的fold‐change <1.5。因此，该基于iTRAQ的定量蛋白质组分析系统具有很高的可重复性。因此，截止值(fold‐change<1.5和fold‐change>1.5)加上统计学显著性p < 0.05可以代表OC和对照线粒体之间的真实生物变化，因此，相对于对照组卵巢组织，OC组织中测定了1198 mtDEPs。 表2 5115个被量化的线粒体蛋白的CV、相关系数(r)和fold‐change B. 人类OCs线粒体蛋白质组的定量参考图 建立了人OC线粒体蛋白质组在卵巢癌细胞和组织中的定量参考图谱。对于CDDP敏感(A2780)和CDDP耐药(A2780‐CP20)的人类OC细胞的线粒体蛋白质组参考图，使用LC‐MS/MS对蛋白质进行分析。从A2780细胞系中共鉴定出1,960个蛋白(8,945个独特肽序列)，从A2780‐CP20细胞系中鉴定出1,680个蛋白(8,624个独特肽序列)。GO分析表明，这些鉴定的蛋白质大部分位于线粒体。还应注意，线粒体蛋白质组参考图常不可避免地包括来自其他细胞间隔的蛋白质，如细胞质、核、内质网、核糖体和溶酶体蛋白质。然而，我们不能否认线粒体蛋白质组学的可靠性，因为它涉及许多因素。例如，构成线粒体外膜的复杂的线粒体-细胞质界面在线粒体和细胞质成分之间有许多连接。此外，大约15%的线粒体蛋白是双定位的。此外，通过IPA分析鉴定的典型通路和网络为CDDP耐药的OC细胞的线粒体蛋白质组提供了潜在的功能系统探索，并且进一步验证了线粒体中四个丰富的典型通路网络蛋白(Nestin、AKAP12、ALCAM和SOD)。其中，nestin被报道在高级别浆液性OC中与nestin相关的微血管密度、总生存时间和无疾病生存时间相关，可能被认为是一种新的抗血管生成药物。AKAP12在紫杉醇耐药的高级别浆液性OC中升高，并与较差的无进展状态和总体生存时间有关。单因素分析和多因素分析均表明过表达A KAP12是一个重要的危险因素。这些发现提供了CDDP敏感细胞(A2780)和CDDP耐药细胞(A2780‐CP20)的线粒体蛋白质组参考图，并突出了它们的分子细胞功能特征。 对于人类OC组织的线粒体蛋白质组学特征，我们使用6‐plex iTRAQ方法研究OC组织与对照卵巢中的mtEPs。从准备的人类OC组织线粒体样本中，总共定量了5,115个mtEPs。将mtEPs与TCGA数据库数据(转录组数据和相应的临床数据，n = 419例OC患者)整合后，发现262个mtEPs与OC患者的总生存率显著相关。本研究首次提供了人类OC中大规模定量组织线粒体蛋白质组分析。对这些mtEPs的进一步分析发现了许多潜在的生物标志物和人类OCs的重要信号通路，这将促使更多的研究开发新的生物标志物并探索其关键机制。通路分析(70个信号通路)和GO富集分析为OC中线粒体蛋白质组分析提供了完整的注释(图3)。对定位于线粒体和重要途径的5个mtEPs进行详细的介绍，包括异柠檬酸脱氢酶[NADP] (IDH2)、GLDC、PCK2、HMGCS2和肉碱棕榈基转移酶II (CPT2)。结果与其他肿瘤发生的研究一致。例如，CPT2分布在线粒体内膜中，在长链脂肪酸的氧化中起作用。CPT2活性缺陷是导致癌症恶病质的主要原因。HMGCS2蛋白是HMG‐CoA合成酶家族的成员，催化酮生成的第一个反应。在癌中抑制HMGCS1表达可以降低细胞内乙酰乙酸水平，降低BRAF与MEK1的结合，抑制MEK1的激活。 图3 iTRAQ鉴定的蛋白的网络分析 (a)根据PANTHER的细胞成分，共有5115种蛋白质被分类。(b) KEGG通路分析将鉴定的蛋白映射到70个信号通路 C. 人类OCs和对照组之间线粒体蛋白质组的差异概况 人类卵巢癌细胞和组织中线粒体蛋白组与对照组的差异也进行了研究。对于人类OC细胞与铂耐药细胞中的线粒体蛋白质组学，我们比较了铂耐药细胞系与相应的化疗敏感细胞系之间的线粒体蛋白DIGE图谱。mtDEPs的确定采用了两倍的匹配点强度差加上p<0.05，在铂耐药细胞中，共有128个凝胶点体积增加，108个凝胶点体积减少。从236个凝胶点中仅选取11个差异凝胶点(组间差异明显)进行MALDI‐TOFMS分析。五种蛋白质，包括抑制性蛋白(PHB)、PRDX3、ETF、ATP‐a和ALDH通过MS鉴定为DEPs，并通过免疫印迹验证。一些已鉴定的铂耐药相关蛋白在多种人类癌症中发挥重要作用，包括OC。如PHB在进化上保守，调节细胞周期，在抑制人类肿瘤和细胞衰老中发挥作用。PHB的抗增殖活性可能定位在3′未翻译区域，并被报道为一种反作用调控RNA。免疫组织化学 (IHC)和TaqMan®实时基因表达检测60名卵巢肿瘤患者和20名健康志愿者中PHB的表达。数据显示，OC组织中PHB明显升高，其PHB的活性可能通过转化生长因子β介导。PRDX3编码产物是一种线粒体蛋白，可以保护细胞免受氧化应激，并与细胞增殖、抗氧化和分化功能的调节有关。PRDX3 mRNA显示较差的总生存率，是OC患者化疗的可靠预后指标。此外，对于人类OC细胞及其紫杉醇耐药细胞之间的线粒体比较蛋白质组学，LC杂交线性离子阱FT‐ICR MS鉴定到542个蛋白，包括SKOV3‐TR/SKOV3细胞中的328个蛋白和A2780‐TR/A2780细胞中的454个蛋白。根据差异比率、高肽匹配评分以及所涉及的生物功能，我们进一步研究了14‐3‐3ζ/δ和mimitin蛋白。OC细胞的紫杉醇耐药指数随着siRNA干扰14‐3‐3ζ/δ和mimitin蛋白而显著改变。这些结果与OC患者的化疗敏感性和耐药性的临床和病理特征一致。这些研究提供了对化疗敏感的人卵巢细胞和对化疗耐药的人卵巢细胞之间的线粒体蛋白组的差异，并证明了线粒体缺陷对OC细胞的化疗耐药的贡献。 对于人类OC组织的线粒体蛋白质组，使用iTRAQ的定量蛋白质组来定量相对于对照组织的人类OC组织中的mtDEPs，共鉴定出1198个mtDEPs。OC中一系列与能量代谢途径相关的酶，包括丙酮酸脱氢酶E1组成亚基β(PDHB)、丙酮酸激酶(PKM)、PFKM、柠檬酸合成酶(CS)、IDH3B、IDH3A、IDH2、2-氧化戊二酸脱氢酶(OGDHL)、ND5、ND2、辅酶细胞色素c还原酶铰链蛋白(UQCRH)和细胞色素b还原酶1(CYB)，这些蛋白质中大部分在OC的发展和转移中是至关重要的。例如，PKM2在OC组织中过表达，并通过免疫组化检测。增加的PKM2通过上调CCND1和下调DKN1A影响细胞周期，在OC的生长、增殖和存活中发挥作用。许多研究证明PKM2可能是OC的治疗靶点。UQCRH基因编码线粒体铰链蛋白，该蛋白在各种癌细胞系中灭活。两株OC细胞系也检测了UQCRH无表达。此外，在OC细胞OAW42中脱甲基剂5‐azacytidine可恢复UQCRH的表达。在1198个线粒体DEPs中，还有许多其他的重要蛋白质具有高变化率(tumor/control ratio <0.30 or >3)，需要进一步研究，如COL2A1, NSPN, SUN2, PUM1, UbC, XIRP1,COX4I2, HIST2H2AB, COL10A1, COL5A2, MAPK4, H2AFZ, NCAM1, SAG, FBN1, APCS,COL1A2, EMILIN3, COL3A1, COMT, COL1A1, GNG4, AIG1, PTTG1IP, S100A14, AGMAT,NMES1, TSPAN1, TGM1, HLA‐DPA1, C1orf53和HLA‐A。综合定量蛋白质组学和TCGA转录组学分析及临床数据(n=419例患者)发现长链非编码RNA (lncRNA) SNHG3可调控EIF4AIII和miRNAs，EIF4AIII和miRNAs可在糖酵解途径中靶向PKM，在糖酵解通路中靶向IDH2和PDHB以及UQCRH在氧化磷酸化(OXPHOS)途径中的作用(图4)。在1198个mtDEPs的基础上，建立了一种7个枢纽分子的特征模型(ALB、HIST1H2BK、RRAS2、RPS20、HIBCH、RPL23A和EIF3E)来预测OC的生存风险。因此，大规模线粒体比较蛋白质组学结合大规模TCGA转录数据和临床数据是建立可靠的枢纽分子和构建OC预后模型的宝贵资源。研究人员还建议结合多中心数据来筛选新的、有效的分子，因为构建的预后模型需要通过大样本的临床调查来验证。 图4 SNHG3与能量代谢在卵巢癌调控中的潜在信号转导机制示意图 D. 人类OCs线粒体磷酸化蛋白组学研究 PTM参与多种BPs，包括蛋白降解、蛋白生物合成、细胞分化、细胞生长、信号传导和调控过程、蛋白间相互作用和基因表达调控。有许多类型PTMs，包括磷酸化、棕榈酰化、二甲基化、糖基化、泛素化、乙酰化、硝化、亚甲基化、甲基化和脱羧。这些PTMs可以通过FT‐ICR MS或LTQ OrbiTrap XL的“top‐down” 和“bottom‐up”分析进行识别和量化。蛋白磷酸化是一种常见的PTM，三分之一的哺乳动物蛋白可能被磷酸化。随着MS蛋白组学的重大发展，线粒体蛋白磷酸化谱已被鉴定，以了解病理生理条件下的分子机制。 Zhan等人提供了一种非常稳健和定量的人类卵巢癌线粒体磷酸化蛋白谱分析。将从OC和对照卵巢组织中纯化的线粒体用胰酶消化，并用iTRAQ试剂标记，并用优化的TiO2珠子富集iTRAQ标记的磷酸肽段，再进行LC‐MS/MS分析。两个MS/MS图谱鉴定磷酸化肽段和磷酸化位点(图5)。与对照组相比，OC组织线粒体中共鉴定了67个具有124个磷酸化位点的线粒体磷酸化蛋白(mtPPs)，包括48个具有84个磷酸化位点的线粒体差异磷酸化蛋白(mtDPPs)(图6)。本研究首次提供了OC患者的大规模线粒体磷酸化蛋白组分析。一定数量的人OC的磷酸化蛋白和相关信号通路将有助于进一步研究开发新的生物标志物和探索关键机制。一些mtPPs被认为是蛋白质相互作用网络中的枢纽分子，包括EIF2S2、RPLP2、cofilin1 (CFL1)、VDAC3、MYH10、RPLP0、HSP90、HSPD1、TMX1、VDAC2、TOMM22、PSMA3和TOMM20。mtPPs中磷酸化位点和功能域的关系也为线粒体蛋白磷酸化及其在OCs中的潜在作用提供了新的见解(图7)。其中一些磷酸化位点在其他OC磷酸化蛋白的研究中也有报道。例如，磷酸化的cofilin 1(p‐CFL1)在紫杉醇耐药OC细胞中高表达。此外，p‐CFL1在原发性人类OC组织的化学耐受病例中表达较多，而在化学敏感性病例中表达较少。根据细胞系和临床数据显示，p‐CFL1与人OC中紫杉醇耐药密切相关。据报道，磷酸化Cav1 (p‐Cav1)与galectin‐3相互作用，而galectin晶格有助于局灶粘连中局灶粘附激酶的稳定性。因此，Cav1可能调节局灶黏附动力学、癌细胞迁移和癌细胞运动。在新辅助治疗前后，乳腺癌组织和癌旁组织中均发现磷酸化的PGRMC1，这可能与治疗反应有关。治疗后的手术标本中pPGRMC1水平较低，提示PGRMC1可能在人肿瘤的治疗耐药中起重要作用。另一项研究表明，MARCKS和phospho‐MARCKS在高侵袭性肺癌细胞系中的表达较高。具体来说，磷酸化标记可能在癌细胞迁移和转移中具有潜在的功能。许多研究表明磷酸化作用对肿瘤细胞蛋白功能活性的重要性，利用相关的磷酸化肽段治疗肿瘤是可能的。线粒体磷酸化蛋白质组分析，包括潜在的生物标志物、信号通路、GO、蛋白-蛋白相互作用网络、蛋白结构域和上游调控将有助于确定OC中线粒体磷酸化的作用。 图6 鉴定线粒体磷酸化蛋白的实验流程图，包括18个之前鉴定的线粒体磷酸化蛋白 图7 线粒体磷酸化蛋白的磷酸化位点和蛋白结构域的鉴定 E. 在人类OCs中整合线粒体蛋白质组数据、全组织蛋白质组数据和转录组数据 OC的发生和发展是一个具有连续复杂变化的慢性过程。所有的研究都证明了OC是多种因素相互作用的结果，涉及到各种过程。癌症是一种全身疾病，其多重后果会导致非常复杂和危险的情况。预测、预防和个性化医学(PPPM)是未来癌症领域的发展方向。内源性和外源性致癌物导致基因组、转录组、蛋白质组、肽组、代谢组和放射组等一系列分子改变，它们相互作用，在肿瘤生物系统中发挥作用。因此，在人类OCs中整合线粒体蛋白质组数据(1,198 mtDEPs)、全组织蛋白质组数据(205 DEPs)和转录组数据(419 OC样本中的20,115个基因)(图8)。在本研究中，在有氧糖酵解、Krebs循环和PXPHOS途径中发现了能量代谢相关酶的上调，如PFKP、PKM、CS、PDHB、IDH2、OGDHL和UQCRH。综合分析显示了OCs的代谢灵活性和能量代谢异质性。OC细胞中存在Warburg效应和反向Warburg效应，调节能量代谢重编程。传统的Warburg效应认为，即使在有氧条件下，癌细胞也更倾向于通过糖酵解途径产生ATP。长期以来，Warburg效应在癌细胞能量代谢的科学观点中占据主导地位。近年来，随着能量代谢研究的深入，研究人员发现，Warburg效应在解释癌细胞能量代谢重编程方面明显存在局限性和过时性。一些证据表明糖酵解为妇科癌细胞提供不到50%的ATP，而OXPHOS是产生能量的主要来源。此外，糖酵解抑制剂并没有获得足够的证据表明糖酵解抑制剂治疗比其他治疗更有效。然而，糖酵解抑制剂的一些不令人满意的疗效被认为是一个更困难的问题，如强烈的副作用或耐药性。基质细胞是肿瘤微环境的重要组成部分之一，在肿瘤发生中起着致瘤作用。“反向Warburg效应”模型与肿瘤细胞在肿瘤微环境中的能量代谢重编程过程有关。癌症细胞通过有氧糖酵解和OXPHOS来依赖能量。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中的一种基质细胞，癌细胞释放的活性氧(ROS)可在氧化应激状态下产生CAFs。在这个过程中，CAFs向细胞外间质分泌丰富的营养物质。这些营养物质可以被癌细胞通过增加Krebs循环和OXPHOS来产生ATP。因此，人们应该更新癌症细胞能量代谢重编程的概念，认为Warburg效应和反向Warburg效应是互补的。 在真核生物基因组中，ncRNAs (microRNAs和lncRNAs)可以调节基因表达、细胞生物过程和基本生物功能。最近的研究表明，lncRNA在OCs中起着至关重要的作用。整合人类OCs中的蛋白质组学数据和转录组学数据，揭示了RNA和蛋白质之间的调控关系，并发现LncRNA SNHG3通过靶向线粒体相关通路(Krebs 循环和OXPHOS)与能量代谢相关。LncRNAs协调线粒体的功能，代表了基于多组学对卵巢肿瘤发生的全新理解。 图8 卵巢癌1198 mtDEPs、205 DEPs和20115 TCGA数据的整合分析实验流程图，以揭示能量代谢异质性及其分子机制。 F. 人类OCs的分子网络改变 在人类OC细胞和组织中发生分子网络改变。为了研究改变的线粒体蛋白质组和人类CDDP敏感细胞(A2780)和CDDP耐药细胞(A2780‐CP20)的CDDP耐药性之间的关系，通过鉴定的线粒体蛋白揭示信号通路和分子网络。比如notch信号、凋亡途径、死亡受体信号转导、干扰素调节因子通路的激活和细胞存活趋势明显与A2780‐CP20亚型相关，但与A2780无关。这些结果表明，线粒体蛋白质组的改变可能与CDDP耐药OC的细胞凋亡、侵袭性和转移性有关。为了研究线粒体蛋白质组改变与人类OCs发病机制的关系，我们构建了基于已鉴定的mtDEPs的分子网络和通路变化。1198 mtDEPs的1174个鉴定标志在OC和对照组织中通过IPA进行网络和通路分析。基于上述1174个鉴定标志，蛋白‐蛋白相互作用(PPIs)提供了这些鉴定的mtDEP与综合评分>0.4的相关性(图9)。以PPIs为基础，鉴定了102个枢纽分子，并用于构建7个枢纽分子特征模型(ALB、HIST1H2BK、HIBCH、RRAS2、EIF3E、RPL23A和RPS20)用于监测OC生存风险。此外，通路网络分析揭示了人类OCs中25个具有统计学意义的网络和192个典型通路。52个典型通路在癌症发病过程中被激活或抑制。这25个mtDEP富集网络显示了广泛的基因功能，如基因表达(复制、重组、DNA修复、蛋白质合成、PTM和蛋白质折叠)、小分子生物化学代谢(核酸代谢、药物代谢和氨基酸代谢)、细胞功能(细胞形态、细胞运动、细胞组装和组织、细胞损伤、细胞死亡和存活)、组织发育(结缔组织紊乱、机体损伤和异常)以及与癌症相关的系统性疾病。这些在每个网络中上调或下调的枢纽mtDEPs为基因网络中mtDEPs的相互作用机制和功能提供了线索。在这些被识别的网络中，许多枢纽mtDEP在OC之前已经被报道过，包括来自于GenCLip3的功能相关基因PIK3CA、CDKN2A、FOLR1、VIM、NTRK1、HMGA1、KRT19、H2AFX、KRT8、NCL、EPHB2、C1QBP、FBN1、PDLIM7、AIFM1、FLNA、XRCC6、HYOU1、SNAP29、EIF3C、PNKD、ELN、FLNB、LGALS3BP和PDIA6 (http://ci./genclip3)。
图9 在卵巢癌组织中发现了中枢分子 根据丰富的信号通路系统和线粒体的多功能，这些重要的典型通路与各种癌症相关的BPs相关。进一步筛选192个有统计学意义的典型途径后，52个有统计学意义的典型途径可能在癌症中被激活或抑制。对这52条被激活或被抑制的典型途径与癌症生物学之间关系的进一步分析揭示了29条与癌症相关的途径，包括抗原递呈途径、线粒体功能障碍、谷胱甘肽介导的解毒作用、EIF2信号、GP6信号通路、α肾上腺素能信号、CREB信号、神经元中的cXCR4信号、EIF4和p70S6K信号的调节、内皮素信号、ephrin受体信号、脂肪酸β氧化I、中性粒细胞中的FLMP信号、G β‐γ通路、Gaq信号、GNRN信号、IGF‐1信号、IL2信号、IL‐8信号、整合素信号、mTOR信号、OC信号、OXPHOS、P2Y purigenic受体信号通路、磷脂酶c信号、Rho家族GTPases信号、生长抑素信号的抗增殖作用、TEC kinse信号和凝血酶信号。本文重点综述了近年来肿瘤研究的热点途径，如OC信号通路、线粒体功能障碍、能量代谢(糖代谢通路和脂代谢通路)、线粒体自噬通路、凋亡信号通路、氧化应激、免疫过程和肿瘤微环境的改变。在1,198个mtDEPs中，OC信号通路中显著富集的蛋白为BCL2、CDKN2A、DVL1、EDNRA、FGFR4、FZD7、GJA1、PRKACA、PRKACB、PRKAR2B、TGS1、PTPN11、RRAS、RRAS2、WNT4、WNT10A、WNT2B和WNT5B。这些被鉴定的蛋白可能与OC的发生密切相关，是进一步研究的可靠数据。线粒体功能障碍通路中显著富集的蛋白有ACO1、AIFM1、ATP5MC1、ATPAF1、ATPAF2、BCL2、COX17、COX4I1、COX4I2、COX6C、COX7A2、COX7A2L、CYB5A、CYC1、CYCS、GPD2、GPX7、HTRA2、MAOB、MT‐ATP6、MT‐CO2、MT‐CO1、MT‐ND2、MT‐CYB、MT‐ND5、OGDH、PRDX5、TXN2、UQCRH和VDAC1。线粒体功能障碍与人类癌症领域的潜在相关性已经被多次报道。线粒体在许多信号通路中具有重要的功能和生物活性，包括OC中的线粒体功能障碍。近十年来，能量代谢重编程引起了很大的争议，至今仍未得出一致的结论。mtDEPs富含能量代谢，包括糖代谢途径(克雷布斯循环和OXPHOS)和脂代谢途径(脂肪酸降解、脂肪酸代谢、丁酸代谢和丙酸代谢)，为OC与对照组织相比的能量代谢改变提供了生物标志物。随着肿瘤免疫学的发展，炎症和免疫已成为抗肿瘤免疫治疗的重要组成部分。凋亡信号通路中显著富集的蛋白包括AIFM1、BCL2、BCL2L1、BIRC6、CAPN2、CAPN6、CAPNS1、CYCS、ENDOG、HTRA2、LMNA、PRKCA、RRAS、RRAS2、SPTAN1。活性物质主要包括一氧化氮自由基、脂类自由基和ROS，是代谢反应的产物。在癌细胞中，信号转导需要高浓度的反应性物质，并产生反应性物质。氧化应激和自由基清除系统在癌症治疗中具有重要意义。其他相关途径也显著富集1198个mtDEPs，包括谷胱甘肽氧化还原反应II途径、谷胱甘肽氧化还原反应I途径、NRF介导的氧化应激反应途径、巨噬细胞中NO和ROS的产生途径以及内质网应激途径。 本文还对肿瘤微环境中线粒体蛋白的改变与宿主细胞功能调节的关系进行了综述。近年来，有报道称线粒体功能障碍与肿瘤微环境中的多种细胞密切相关。用1,198mtDEPs鉴定了与肿瘤微环境密切相关的大量通路，包括对基质金属蛋白酶途径的抑制，整合素，肿瘤通路中的组织因子信号传导，gap连接和紧密连接。 OCs中基于线粒体的分子通路和网络研究对我们更好地理解卵巢肿瘤的发生具有重要意义，并为OCs的治疗提供了新的生物标志物和方法。 G. 人类OCs的生物标记物和治疗靶点 癌症生物标志物可以分为两种类型:第一种类型的生物标志物有助于预测、诊断和预后，第二种类型的生物标志物有助于机制和治疗靶点。用于评估的生物标志物需要具有良好的敏感性和特异性，根据定量变化容易检测到。机制和治疗靶点的生物标志物需要与癌症的发生/进展密切相关。这类生物标志物在网络中一直起着关键作用或枢纽基因的作用。在已公布的数据中，单因素模型对癌症的影响仍然处于领先地位。然而，癌症是多基因、多期参与的。人们已经构想了PPPM在癌症中的多参数系统策略。 以iTRAQ为基础的OC线粒体定量蛋白质组在OC和对照组织中定量5115 mtEPs。结合TCGA转录组数据和临床信息，发现262个蛋白与OC患者的生存预后显著相关。通过GenCLiP3网站(http://ci./genclip3/analysis.php)检索的63个mtEP被报道为OC的潜在生物标志物。这些蛋白质数据是人类OC的首个组织线粒体蛋白质组参考图。这些发现有助于建立人类线粒体蛋白质组数据库，并为临床实践提供有用的生物标志物。此外，利用分子复合检测方法对1198个mtDEPs和102个枢纽分子进行了识别，并利用多元回归建立了枢纽分子的特征模型。多元回归推导出的7个枢纽分子特征模型(ALB、HIST1H2BK、HIBCH、RRAS2、RPS20、EIF3E、RPL23A)可评估OC的生存风险。这些识别出的mtEPs、mtDEPs，特别是模式生物标志物，可用于OCs的预测、诊断和预后评估；然而，它们仍然需要进一步的临床实践来验证。 通过不同的治疗方法来靶向线粒体而治疗癌症已经有报道，其中包括靶向ROS，线粒体代谢，线粒体外膜通透性，通透性过渡孔复合物，线粒体靶向光动力的治疗方法。以线粒体为靶点作为OC治疗策略的最相关药物包括可活化的纳米颗粒、波斯湾海洋软体动物的提取物、裂解肽(YX-1)、多功能肿瘤靶向纳米超声造影剂、阿霉素、氯硝柳胺、FDA批准的抗生素、ABT737、印黄酮、甘草次酸罗丹明B苄酰胺35、TEMPO、复合体1‐AMP、linTT1、接骨木凝集素、槲皮素、渡金属化合物、外泌体miRNAs、重组腺病毒Cre/loxP调控系统、来自入侵植物的代谢物、PTC‐209、2,2′‐dipyridyl‐N,N‐dimethylsemicarbazone (Dp44mT)、硫咪脲铁螯合剂三嗪、AMRI‐59、RY‐2f、PENAO、一种混合药物二氯乙酰铂(II)、优化的以线粒体为目标的氯硼化合物、[Pt(BDI(QQ))]、SW III‐123、埃博霉素、STX140和STX641、Flex‐Het、胡椒碱、尼罗替尼 (AMN)、棕矢车菊素、盐霉素、二甲双胍、doxycycline、elesclomol sodium、ABT‐263和AT‐101/CDDP。本文总结了以线粒体为靶点并涉及OC机制的线粒体抑制剂(表3)。
靶向线粒体分子的癌症治疗的发展需要考虑药物选择性，包括特异性识别和选择性积累。识别癌细胞特异性靶点和正常细胞之间的细微差别有助于发现具有选择性作用的分子。这表明比较线粒体蛋白质组学和线粒体磷酸化蛋白质组学在OCs中的研究具有重要意义。一项基于线粒体的研究可能为OC的药物作用靶点和分子机制提供新的见解。 4. 展望 A. 线粒体蛋白质组数据库的扩展和改善 许多研究在努力开发线粒体蛋白质组数据库，其中包括已报道的大规模线粒体蛋白质组，以提供有关线粒体蛋白质的信息和参考图。一些线粒体相关数据库已经发布(表4)，包括人类线粒体蛋白质数据库，Human MitoCarta 2.0, Mitomap, MPIC, MitoMiner,Mitoproteome, InterMitoBase, MITOP2, MitoRes, MitoInteracto, the MitochondrialProtein Atlas和Proteome Comparison of human mitochondria。到目前为止，总共大约已经鉴定出3700个线粒体蛋白。在我们的研究中，在人类OCs中鉴定出5115个mtEPs，表明在一个线粒体蛋白质组中存在更多的线粒体蛋白。本研究有助于线粒体蛋白质组数据库的扩展和完善，而这项定量线粒体蛋白质组研究增加了聚焦于OC生物标志物和分子机制的内容。由于多种蛋白质与线粒体外膜相互作用，在线粒体蛋白质组学研究中发现其他细胞成分是合理和常见的。尽管蛋白质组学技术取得了巨大进步，但获取高质量的线粒体蛋白质组数据仍然是一个挑战。最基本的需要是严格控制线粒体蛋白的分离和纯化。此外，谨慎处理已识别的线粒体蛋白质，并用多种方法实验验证线粒体蛋白质组数据也很重要。此外，以目前的线粒体蛋白质组学方法，还没有识别出所有的线粒体蛋白质，也有必要开发高灵敏度的蛋白质组学技术来识别OC线粒体蛋白质组中的所有成分，以进一步扩大和完善线粒体蛋白质组数据库。 表4 线粒体蛋白质组相关数据库
B. 人类OCs的线粒体修饰蛋白组学 随着线粒体蛋白质组学技术的发展，PTMs，如乙酰化、泛素化、羰基化、磷酸化、氧化过程、亚硝基化或糖基化，被证明与控制线粒体功能和多种病理状态密切相关。近年来在人类OCs中发现了线粒体PTMs。例如，与其他化合物(细胞质或细胞核)相比，线粒体蛋白质组具有高度乙酰化的倾向，关键相关蛋白的乙酰化/去乙酰化在调节线粒体适应性和生物学的基本方面发挥着重要作用。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以促进细胞凋亡，这一点可以通过线粒体跨膜电位的丧失以及OC细胞中p16、p27KIP1、p21WAF1和cyclin A表达的改变来证实。蛋白质泛素化也被认为是主要调控因子，如泛素特异性肽酶13，它通过上调氧化戊二酸脱氢酶和ATP柠檬酸裂解酶来驱动OC代谢。这两种关键的酶是线粒体呼吸途径的重要成员。羰基化是一种不可逆的损伤修饰，可以作为氧化损伤的指标来衡量。恶性浆液性卵巢样本具有明显较高的反应性羰基含量，这表明羰基化与氧化应激下的OC有关。研究发现线粒体中存在蛋白磷酸化并发挥作用。利用人磷酸化激酶阵列分析信号通路的激活，如大蒜素诱导JNK磷酸化并触发SKOV3中线粒体介导的细胞凋亡信号通路。尽管与其他CCs相比，线粒体中的磷蛋白很少，可逆磷酸化在细胞过程的调控中发挥更广泛的作用。线粒体磷酸化蛋白及其它们涉及潜在的细胞过程是人类OCs线粒体修饰蛋白组学的重要组成部分，迫切需要形成参考图谱以供进一步研究。与对照组相比，已在人类OC组织线粒体中鉴定出来自67 mtDPPs的85个磷酸肽中的124个磷酸化位点，其中包括来自48 mtDPPs的57个差异磷酸化肽中的84个磷酸化位点。这些数据提供了关于人OC全面的分析和线粒体磷蛋白信息。我们坚信这些线粒体PTM研究只是线粒体PTMs的一个窗口，因为在人体中至少有400个PTMs。此外，阐明这些PTMS之间的竞争效应和协同效应，以调节人类OCs中的线粒体功能，也是非常必要的。因此，有必要扩大更多的PTMs的研究，阐明竞争性和协同效应在调控蛋白质和线粒体功能中的作用。 C. 人类OCs中的线粒体蛋白质形态 直到最近，大多数研究者仍然认为每个人类蛋白质编码基因都被相应地转录和翻译成单个蛋白质。然而，蛋白质形态或蛋白质种类的概念正在改变原有的传统模型——每个蛋白质被定义为一组来自一个基因的蛋白质形态，一个蛋白质被定义为一个蛋白质序列+ PTMs +位置+空间构象+辅助因子+一个功能。据估计，人类蛋白质组是由一百万种蛋白质或蛋白质形式组成的。大量的研究表明了蛋白质形态的可能性和重要性，是蛋白质组学概念创新之一。例如，每个双向凝胶电泳(2DGE)点通常被认为只含有一到两种蛋白质。然而，随着基于高灵敏度质谱仪的2DGE分辨率的发展，使用LC Orbitrap Velos MS分析，每个考马斯蓝染色2DGE点平均至少鉴定出50或数百个蛋白样。本研究证明了蛋白形态的存在，并显示了2DGE‐MS分离大规模蛋白种类或蛋白形态的能力。此外，蛋白质形式的鉴定也有助于了解个体分子谱和疾病的表型。随着蛋白质组学方法的进展，新的生物标志物的识别有望根据与各种疾病表型相关的异常蛋白形式。复杂系统中蛋白质形态的识别是蛋白质组学的关键挑战，如线粒体。目前的研究已经使用自顶向下的质谱分析完整的蛋白质，以确定和量化小鼠线粒体蛋白形式。这一策略增强了蛋白形态的鉴定，表明将传统的自顶向下质谱和完整的质量蛋白整合来鉴定蛋白形态是可行的。虽然自顶向下蛋白质组学是一种准确的方法来鉴定和量化蛋白质，但其吞吐量是有限的。Zhan等发现2DGELC质谱/质谱具有大规模研究蛋白质谱的能力，将在OCs线粒体蛋白形态分析中发挥重要作用。人类OCs的线粒体蛋白质形态尚未得到研究；该研究将是阐明人类OC线粒体蛋白样家族的一个重要领域，具有重要的科学价值。 D. 人类OCs中线粒体蛋白质组学与其他组学数据的整合 线粒体蛋白质组学与多组学的结合，如基因组学、转录组学、脂组学、代谢组学和放射组学，可以有助于全面理解线粒体蛋白质的功能。对透明细胞OCs和卵巢子宫内膜样癌进行RNA测序和质谱分析。为了评估ARID1A突变引起的蛋白质组学变化，我们使用外显子组测序来鉴定ARID1A突变，使用MALDI TOF MS来确定ARID1A突变的DEPs。使用多变量回归分析ARID1A突变与蛋白磷酸化之间的关系。蛋白质组学和基因组学的整合将阐明基因组异常与癌症表型的潜在关联，并发现更可靠的新的候选生物标志物用于诊断和治疗，这可以用靶向的MS方法进行验证。大规模协同精准医疗项目和数据库(如TCGA)被用于收集丰富的多组数据，包括人类OC中的体细胞突变、DNA甲基化、拷贝数改变、基因表达、miRNAs、lncRNAs和蛋白表达。例如，通过整合线粒体蛋白质组数据和TCGA转录组发现lncRNA SNHG3可以调节OC的能量代谢，262个mtEPs与OC患者的总体生存显著相关，63个mtEPs是OC发生发展的潜在生物标志物。结合线粒体蛋白质组学和其他组学技术，为全面阐明线粒体在OCs中的生物学作用提供了机会，并将有利于OC精准医学的预测、诊断和治疗。 E.人类OCs中基于分子通路网络的生物标记物和治疗靶点 目前，虽然在人类OCs中已经积累了大量的线粒体比较蛋白质组数据，但线粒体蛋白质组学仍面临许多问题和困境；例如，如何研究已鉴定的未评论线粒体蛋白的生物功能，如何构建线粒体特定信号网络，如何分离和分析线粒体蛋白-蛋白相互作用如整个复合物或超级复合体，和如何选择可靠且关键的生物标志物来构建包含一系列分子的数据模型。生物信息学应该有助于回答这些问题。例如，信号通路网络通过IPA分析进行挖掘，枢纽分子被识别并用于开发枢纽分子特征模型，以评估OC生存风险。利用加权基因共表达网络分析建立共表达基因模块，寻找临床性状相关分子。选择与临床性状相关的基因共表达模块，并利用共表达模块中的枢纽基因进一步建立基因签名的预后模型。此外，根据OC的糖代谢通路，lncRNA SNHG3被认为是靶向OC糖代谢通路的潜在治疗靶点。多种分析方法的整合将为基于分子通路网络的人类OCs生物标志物和治疗靶点提供多视角特征选择。随着多组学和系统生物学的发展，癌症实践中必须从单因素模型向多参数系统模型转变。分子通路网络是实现这种模式改变的重要途径，而基于分子通路网络的生物标志物和治疗靶点将在癌症治疗中更加可靠、有效。在此，我们推荐并强调分子通路网络在识别可靠而有效的人类OCs生物标志物和治疗靶点方面的高度科学价值。 5. 结论 线粒体在影响肿瘤发生、进展、生长、转移、血管生成和生存等生物学行为方面具有非常复杂的功能。除了积极产生能量代谢外，线粒体还具有广泛的影响癌细胞的生物学功能，如mtDNA突变、有丝分裂、转录和信号网络、生物发生和循环、氧化应激、裂变和融合动力学、耐药性、细胞凋亡和死亡、干性和代谢重编程。此外，越来越多的证据表明，线粒体可以通过一些未知的过程进入细胞质非编码RNA。近年来有关RNA导入线粒体的功能影响和分子机制的研究进展，使线粒体生物学的研究更加复杂和丰富。线粒体也与其他细胞器(过氧化物酶体和内质网)和细胞核通过囊泡运输、信号转导和膜接触位点进行通信。线粒体生物学的相互作用导致了人类癌症中一个复杂的调节系统。线粒体的灵活性和可塑性也可用于解决肿瘤免疫逃逸机制、多药耐药和辐射敏感性等癌症治疗问题。因此，在慢性阻塞性肺疾病的联合治疗中，必须考虑将靶向线粒体作为一种治疗干预手段。 多组学为阐明OC中线粒体的多种生物学功能提供了重要的潜力。我们建立了人类OC与对照卵巢组织的线粒体蛋白质组分析，构建了基于线粒体蛋白质组数据的分子通路网络，以探索OC的分子机制并发现OC的生物标志物和治疗靶点。此外，线粒体蛋白质组学已被用于分析OC细胞的相关药物敏感性、耐药性和辐射耐药性。另外，线粒体蛋白质组学和其他组学数据的整合有助于全面理解线粒体在OC中的生物学功能，并有助于有效和精确地治疗卵巢病变。在这里，我们进一步强调，线粒体功能障碍和能量缺乏是癌症的标志，包括OC和乳腺癌。线粒体蛋白质组学与其他组学的结合将是了解癌症生物学、发现新的癌症治疗靶点、为患者分层和个性化治疗识别有效的生物标志物的有效方法。本文提出了这种在OC中基于MS的线粒体蛋白质组学与其他组学技术相结合，是使患者受益的一流研究和实施的极具吸引力的策略，这是原理模型的证明，该模型可轻松应用于其他类型的癌症，尤其是最具侵袭性的乳腺癌伴有线粒体功能障碍/能量缺乏。
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