PRM蛋白组学技术

        PRM（平行反应监测，Parallel Reaction Monitoring）目前靶向蛋白质组学数据采集的主流方法，通过对特异性肽段或目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/修饰肽段的靶向相对或绝对定量。

PRM技术原理

        平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能够对目标蛋白质、目标肽段（如发生翻译后修饰的肽段）进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段的定量。首先利用四级杆质量分析器的选择检测能力，在一级质谱中选择性地检测目标肽段的母离子信息。随后，在collision cell中对母离子进行碎裂；最后利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行准确地特异性分析。

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技术优势

1. 灵敏度、重现性和准确度高，定量范围可达到5个数量级

2. 不需要使用抗体，获得更为准确和重现的定量验证结果

3. 在一个小时检测时间内可同时实现50个蛋白质的定量检测

4. 可直接检测二级所有离子，减少了子离子的挑选和优化过程

样品要求

应用方向

• 验证定量蛋白质组学结果，验证翻译后修饰蛋白质组学结果

• 目标蛋白质相对定量分析，目标蛋白质绝对定量分析

• 诊断标志物靶向筛选；诊断标志物验证与绝对定量；验证基因表达产物

案例解析

PRM技术定量蛋白磷酸化修饰

        该文章通过定量磷酸化蛋白质组学技术得到癌症病人样品中的蛋白磷酸化的变化，然后用PRM技术对挑选出的目标蛋白磷酸化位点的变化进行更精准地定量和验证。

磷酸化定量蛋白质组学技术

        本项研究采用的是乳腺癌患者的血浆样品，通过超高速离心方法从人血浆样品中分离出微囊泡和外泌体，进行蛋白质提取和胰酶消化，获得的多肽采用非标记定量蛋白质组学Label free方法，比较正常人和乳腺癌患者血浆微囊泡和外泌体中蛋白磷酸化的差异变化（图1）。

                                       图1  磷酸化蛋白质组学流程

        本研究对微泡和外泌体蛋白组的定量分析显示，大多数蛋白在正常人和癌症患者中的蛋白质表达非常相似（图2），但患者血浆中微泡和外泌体蛋白质的磷酸化更多，表明乳腺癌患者磷酸化差异并不是蛋白质表达变化的结果，并且更有潜力成为标志物。

                                                图2   磷酸化蛋白组（左）和蛋白组（右）的火山图

PRM技术验证癌症患者的特异性磷酸化

        为了验证乳腺癌患者微囊泡和外泌体中蛋白磷酸化成为潜在标志物的可能性，研究人员采用了PRM技术进行了后续验证。PRM验证阶段共选择了4个磷酸蛋白：RALGAPA 2、PKG 1、TJP2和NFX 1，对13例癌症患者(8例)和7例健康对照者(另加1例)的血浆EV（包括微囊泡和外泌体）进行定量测定。从图3可以看出，乳腺癌患者的RALGAPA 2、PKG 1和TJP2水平明显高于对照组。然而，与Label free定量蛋白组学分析结果相比，在PRM中蛋白差异倍数明显减小，特别是NFX 1磷酸化仅在乳腺癌标本中发现，而在健康对照组中没有发现。

                                                                           图3  PRM技术对潜在标志物的验证

小结

        本研究通过采用Label free技术分析了癌症病人血浆微囊泡和外泌体中的磷酸化蛋白组差异，再利用PRM技术进行验证，证实了血浆微囊泡和外泌体中RALGAPA 2、PKG 1和TJP2蛋白的磷酸化变化可以作为乳腺癌诊断的潜在标志物。

        华盈生物可以提供蛋白质组学一站式服务，整合蛋白质组学筛选(Label free、iTRAQ、TMT、DIA)和PRM验证服务，帮助研究人员系统性解决蛋白组学研究中各环节的技术问题。

相关文献

1. Wang Z，et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs. Sci Rep. 2017 Apr 24;7:46717.

2. Dozio V，et al. Characterisation of extracellular vesicle-subsets derived from brain endothelial cells and analysis of their protein cargo modulation after TNF exposure. J Extracell Vesicles. 2017 Apr 19;6(1):1302705.

3. Kim HJ, et al. Quantitative Profiling of Protein Tyrosine Kinases in Human Cancer Cell Lines by Multiplexed Parallel Reaction Monitoring Assays. Mol Cell Proteomics. 2016 Feb;15(2):682-91.

4. Majovsky P, et al. Targeted proteomics analysis of protein degradation in plant signaling on an LTQ-Orbitrap mass spectrometer. J Proteome Res. 2014 Oct 3;13(10):4246-58.