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欧阳玉琨 陈祥军 本文来源：《中华整形外科杂志》2019年11月 第35卷 第11期 DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-4598.2019.11.017 作者单位：贵州医科大学附属医院整形烧伤科,贵阳 550000 通信作者：陈祥军,Email: 1711369219@ qq.com 【摘要】 自体颗粒脂肪移植因其取材丰富、组织相容性好,近年来广泛应用于临床及科研探索。目前已有众多学者针对提高自体脂肪移植成活率做了大量研究,不仅着眼于脂肪移植的成活理论、各步骤操作过程、评估指标及术后处理等,还涉及到各个相关领域,如组织工程、基因工程、缓释技术等。该文对这些影响自体脂肪移植成活率的相关因素进行了综述。 【关键词】脂肪移植; 自体移植物; 成活率 Research progress on the factors related to the survival rate of autologous fat grafting Ouyang Yukun, Chen Xiangjun Department of Plastic and Burn Surgery,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550000,China Corresponding author: Chen Xiangjun,Email: 1711369219@ qq.com 【Summary】 Autologous granule fat transplantation has been widely used in clinical and scientific research in recent years because of its adequate sources and good histocompatibility. There are many scholars made a lot of research to enhance the survival rate of autologous fat transplantation, not only focus on the survival of fat transplantation theory, the process steps, evaluation index and postoperative treatment etc, also involves the various related fields, such as tissue engineering, gene engineering, slow release technology, etc. The relevant factors affecting the survival rate of autologous fat transplantation are summarized as follows. 【 Key words】 Fat transplantation; Autograft; Survival rate; Factor Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article. 自体颗粒脂肪移植因其取材丰富、组织相容性好,自Neuber 1893 年率先将自体脂肪移植用于治疗软组织缺损以来,近年来被广泛应用于凹陷填充、外伤后缺损、丰胸、丰臀、面部年轻化等,甚至在声带麻痹、神经节功能受损的修复方面也有不俗表现。然而,移植后脂肪颗粒吸收率高、远期存活率低,这成为近来整形外科领域重点研究的课题之一。现将影响自体脂肪移植成活率的相关因素综述如下。 一、脂肪移植后转归的相关理论 目前关于脂肪移植后的转归有以下3 种理论:(1)宿主细胞替代理论。Neuhof[1] 认为移植的脂肪细胞不会存活,而是由宿主间质细胞吞噬降解脂肪细胞所释放的脂质,变成新的脂肪组织 。(2)细胞存活理论。Lyndon[2] 认为部分移植的脂肪细胞能够存活,而宿主组织细胞仅仅起到清除脂质及坏死的脂肪细胞的作用,并不能取代移植的脂肪细胞。(3)前脂肪细胞理论。Robin 和Roncari[3] 认为前脂肪细胞是脂肪组织中含有的一种类似成纤维细胞样的间充质细胞。脂肪移植后大部分成熟的脂肪细胞不能存活,而前脂肪细胞可以存活并转化为脂肪细胞,促进再血管化,提高脂肪成活率。 目前,前脂肪细胞理论更广为接受,它为脂肪移植后的永久填充效果提供了充分的理论基础。基于此理论,目前在临床广泛应用的CAL 技术[4-6] 、SVF-Gel[7] 、脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)辅助脂肪移植技术[8-10]均频繁见诸报道。 二、脂肪移植手术中的干预措施 (一)术前干预 虽然关于“移植微环境”这一概念并没有在大多数文献中强调,但仍然有必要先建立这一概念,这样便于理解在操作中是通过干预移植的哪一个阶段来提高脂肪移植成活率的。通过阅读文献,我们认为对术区的预处理及添加生长因子等手段可归纳为改善移植微环境这一范畴中。 移植微环境:在脂肪移植早期,颗粒脂肪尚未与受区建立血液供应,此时,仅依靠周围组织的血浆灌注获取氧及营养,直至3 d 后内部血管化形成及毛细血管逐渐建立,才能改善颗粒脂肪的缺血缺氧状态。但在后期观察中发现存活的脂肪颗粒范围大于组织间液的渗透范围[11] ,由此可知,移植后期存在脂肪组织的血运重建过程。Nguyen等[12] 指出受区血运重建对移植物的存活至关重要,且脂肪细胞具有高耗能特性,若缺血缺氧则容易导致脂肪纤维化甚至坏死。术前对即将移植的脂肪组织进行局部缺血预处理,如脂肪瓣延迟术,通过缺血的刺激提高脂肪组织VEGF 的水平,促进血管增生。有文献报道,低氧环境有助于间充质干细胞向脂肪细胞转化[13] 。Soares 等[14] 通过磷酸二酯酶-5 抑制剂枸橼酸西地那非片来保护微脉管系统,追踪24 周证实其在维持微脉管系统中具有促进血管再生和存活的作用,从而增加移植脂肪的长期成活量。但尚缺乏在人体中的对照实验。李东等[15] 认为Periostin(骨膜蛋白)能为细胞提供生存的微环境,促进移植脂肪的成活。细胞因子方面,如碱性成纤维细胞生长因子可促进移植区早期血运重建,减少术后脂肪移植体吸收,从而提高其成活率;血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管生成素、肝细胞生长因子、瘦素[16] 等均可有效促进血管内皮细胞的增殖和分化,从而增加移植脂肪的远期成活率。目前发现的作用最强、特异性最高的生长因子是VEGF。 近年来,富血小板血浆(PRP)因其在促进脂肪移植物的存活[17] 以及对促进慢性创面的快速愈合[18] 方面的显著疗效而逐渐成为研究热点。血小板激活后可释放多种生长因子,如血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、转移生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、类胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF) 等,其中PDGF 和TGF-β 尤为重要[19] 。根据分离成分的差异PRP 又可细分为:P-PRP(纯富含血小板血浆)、L-PRP(白细胞-富含血小板血浆)、P-PRF(纯富含血小板纤维蛋白)、LPRF(白细胞-富含血小板纤维蛋白)。在脂肪移植中,无论是单独添加PRP 还是联合基质血管成分(stromal vascular fraction,SVF)、提取和分离的完整脂肪颗粒(adipose granus, AG),都能提高脂肪移植的成活率[20] 。PRP 的优点在于来自自体,缺乏表面抗原,避免了过敏的发生。 一项追踪随访6 年81 例行Brava 和自体脂肪移植的临床研究[4] 显示:使用负压吸引装置(Brava)可通过增加受区毛细血管充盈,促进血液循环,增加组织间血液灌注,进而提高脂肪移植成活率。 (二)术中干预 1. 颗粒脂肪的获取:获取方法有剪碎法和抽吸法。文献报道[22] ,虽然剪碎法对脂肪细胞的损伤最轻,但对取材部位损伤较大,故弃而不用。抽吸法包括手动操作注射器吸脂、水动力辅助吸脂和传统设备(如超声、共振)吸脂。就抽吸压力而言,张新合和高建华[21] 研究显示,当负压吸脂压力<-50 kPa 时,对脂肪细胞损伤程度无明显差异;>-50 kPa时,压力越大,对脂肪细胞的损伤程度越大。故目前临床上较多学者建议用注射器低压吸脂法,即通过手抽法,用10 ml或20 ml 注射器维持抽吸负压不高于0. 5 个大气压。在吸脂管径方面,Erdim 等[22] 发现:直径6 mm 的吸脂针较更小直径的吸脂针所获得的脂肪活性更高,当吸脂针直径过小时易损伤移植脂肪组织,从而影响成活率。究竟3 种方式对ADSC 的数量、活性、CFU(形成单元细胞团)或SVF 成分的比例影响如何呢? Hosseini 等[23] 通过流式细胞仪对SVF 细胞表面标记物CD34+、CD31-、CD45-进行测定,认为3 种抽吸方式无明显差别。 取材部位:皮下脂肪分为深层和浅层,深层为板状层,此部位取材容易,术后并发症较少。大腿内侧板状层为最佳取脂部位。因大腿部脂蛋白酶(lipoprotein lipase,LPL)活性最高,其余依次为臀部、下腹部、上腹部。大腿的脂肪细胞较小,完整脂肪细胞多,血管易生长,移植后容易建立良好的血运。Padoin 等[24] 的研究显示:大腿内侧和下腹部的脂肪组织含较多的脂肪干细胞,更利于移植后脂肪的存活。 在移植早期,还有一点需要注意的是移植脂肪颗粒所受到的压力,在追求受区丰富的血液供应的同时,应兼顾到低应力的生存环境。石岩[11] 认为,最佳受区为肌肉内,认为移植的颗粒脂肪在肌肉内时血管化最好,但远期效果并不满意,原因可能是肌肉间空隙较小(Rieck),且在肌肉拉伸过程中,肌肉的持续性运动会抑制脂肪细胞的成脂分化。长期观察发现脂肪垫内移植的脂肪颗粒成脂效果最好,除低应力和无动态机械力影响外,脂肪垫内含有的大量ASCs 以及其他细胞分泌的促成脂的因子营造了一个适宜成脂的微环境,另外,受区的组织生理因素(如血供、组织疏松程度等)也影响脂肪颗粒的存活率。 2. 脂肪纯化的方法:包括静置法、过滤法、离心法。静置法中根据是否采用生理盐水漂洗分为自然悬浮漂洗沉积法和不漂洗的方法。其中静置法、过滤法被认为纯化后杂质残余相对较多,但能最大限度保护脂肪颗粒免受损伤[25] 。离心法纯化效率高,虽然对于一个恰当的离心速率尚未达成一致共识,但公认的是离心速率越大,移植物的细胞活性越低。雷华和李青峰[26] 指出当离心速率≥600 r/ min 时可对颗粒脂肪的活性造成不可逆的损伤,故建议慎用离心法。但Del Vecchio[27] 通过流式细胞术和酶联免疫吸附实验得出结论:离心后高密度脂肪抽吸物中,VEGF、SVF、PDGF 和脂连蛋白的含量均比低密度的高,并且通过2~10 周的实验比较,高密度脂肪抽吸物细胞群可保持更高的存活百分比。因为前者含有更多的祖细胞和更大浓度的多种血管形成介质,较后者更有利于血管形成。临床中,对于采用静置法、离心法以及纯化脂肪的效果观察均有大样本成功的报道。就离心法而言, 如转速为< 1 000 r/ min[28] 、1 000 r/ min[29] 、3 000 r/ min[30] 、3 500 r/ min[31] 都可取得较为满意的预后。目前的临床应用及疗效观察尚无法得出结论究竟哪一种脂肪纯化方法更好,但对于缩短暴露时间,提高纯度而言,离心法似乎更具优势;就简化操作流程、降低人为因素对脂肪的损伤、降低感染可能而言,静置法则是更优的选择。 3. 颗粒脂肪注射:Xie 等[32] 提出脂肪注射移植时的“3Ls”和“3Ms”技术,即低压抽吸、低速离心、低量注射,多隧道、多层次、多点注射,但容易产生“卡壳”现象。而高压注射对脂肪细胞会造成损伤,且高压造成的高剪切应力,对移植物的存活有不利影响。针对这一现象周长兵等[33] 提出了“腔隙式”注射脂肪颗粒移植方法,这一预处理方式在一定程度上能够减少“卡壳”的发生,然而也增加了对受区微小血管的损伤。 Lee 等[34] 发现剪切应力(即注射推送速率)能影响术中脂肪移植量, 体内研究表明, 缓慢注射的方式( 0. 5 ~1. 0 ml/ s)比快速注射(3. 0 ~ 5. 0 ml/ s) 的移植物质量多38%,即注射推送速率会对脂肪移植物的存活能力造成明显影响;安然等[35] 建议针对不同受区选择适宜管径的注射针,在允许范围内尽量采用管径相对较粗者。就注射方法而言,目前有注射器法、注射枪法(包括棘轮枪和MAFT-GUN)、螺纹与螺旋推注法、气压推注法、电动推注法、齿轮协调恒量推注装置,目前较为常用的是注射器法,旨在减少注射过程中对脂肪细胞的损伤[36] 。 近几年有学者提出“单房脂肪细胞移植”,即将脂肪组织通过酶学消化为单房脂肪细胞后再行移植,认为该方法能够有效避免移植物的坏死,从而提高脂肪成活率。这种方法尚需要临床大样本的进一步证实其优越性。 (三)术后干预 术后及早建立有效的血液循环是脂肪存活的关键,而术后血肿及脂肪团块的形成会影响血运,从而降低成活率。有众多学者提出术后即刻应采用适度加压包扎法。关于术后是否按摩受区,分歧较大。Coleman 观点认为,在填充后不应立即按摩受区,这样的操作很难控制皮下移植脂肪量的分布,甚至会造成脂肪向四周喷射形成不规则的组织团块,从而影响脂肪的成活率;而目前大多数临床案例报道均表示填充即刻可轻柔按摩术区,利于颗粒脂肪的均匀分布和塑形;这两种做法的出发点旨在减少脂肪团块的形成,故应就受区部位、移植剂量酌情考虑。除此之外,术后24 h 禁忌持续暴力按摩和热敷,以免脂肪液化降低成活率。一旦发生脂肪液化,一般的抗生素药物治疗后都可好转,无需切开引流[37] 。 感染是影响脂肪成活的又一关键因素。感染可使组织细胞被大量炎性细胞浸润,血流增快,造成脂肪细胞不能成活,最终全部被吸收,严重时还会导致移植受区红肿、破溃,某些感染甚至经久不愈,演变成慢性皮肤溃疡等,故防治感染尤为重要。有学者建议必要时可在移植的颗粒脂肪中加入抗生素[38] 。 另外,脂肪具有“生理同源性[39] ”,移植术后的刻意节食减肥会造成供区部位脂肪体积减小,该效应会影响受区移植的脂肪体积减小,从而造成受区填充的脂肪饱满程度受到影响,降低术后患者的满意程度。 三、评估指标 目前测定脂肪活力的方法有以下几种。(1)活细胞计数:用台盼蓝染色方法进行计数。由于操作过程中采用了细胞分离的方法,故不能精确反映一整块组织中的脂肪移植物活力。(2)四唑盐比色法(XTT)。该法用于检测活细胞相对敏感,其局限性在于XTT 实验并非脂肪细胞特异检测方法,故其他移植脂肪中的活细胞———血源性细胞、内皮细胞、脂肪来源干细胞和成纤维细胞,都可影响总的吸收值。(3)甘油三磷酸脱氢酶(G3PDH)的检测。目前已有制造商生产出能直接测定细胞质内酶的含量的G3PDH 检测试剂盒,联合分光光度法进行测定。目前认为,就特异性而言,G3PDH 更优于XTT。但该法局限性在于,只能用在酶消化和离心后检测,而这可能破坏部分比例的脂肪细胞。(4)组织学方法:HE 染色、油红O 染色、扫描电镜观察。该法不能用于评价脂肪移植物实际的活性,但可与上述方法联合使用,作为一种补充方法用于证实脂肪的结构完整性。上述方法各有优缺点,在Coleman 时代所采用的首选方案是:联合活细胞计数、G3PDH 检验和常规的组织学检查的方法判断脂肪移植的活性[37] 。 近年来,在体外检测脂肪细胞活性方面,安然等[35] 使用Calcein- AM/ Hoechst33342 染色法;刘锋等[40] 采用葡萄糖转运法;李东等[15] 采用RT-PCR 检测CD133 及CD144 基因的表达情况,评估移植脂肪的成活率。但上述方法均为体外研究。故而近年来,不断有学者探索对于脂肪移植后临床效果的评价方法,从而间接评价移植后脂肪的成活率。如Eric等[41] 对行面部脂肪注射美容手术的患者在手术6~12 个月后采用MRI 成像扫描, 测定颊部厚度, 评估其疗效。Schendel[42] 采用Vultus 3D 摄影测量扫描系统进行扫描,评测面部脂肪移植量。Fontedevila 等[43] 采用计算机X 线断层照相术测量脂肪组织量,认为此方法较为客观,并采用面部脂肪萎缩的HIV 患者作为研究对象,他们皮下脂肪层几乎完全缺失,旨在消除偏差。对于移植效果,常用受区移植脂肪的体积保留程度来评价疗效,借助于影像学的CT、MRI、B 超等[44] 进行脂肪组织的体积评估和计算,3D 照相与激光扫描因其可立体成像,故也常应用于术前和术后的对比中。 四、相关领域研究 (一)组织工程与基因工程 Schendel[42] 证实存活的脂肪量与SVF 细胞数量呈正相关。Zhou 等[45] 发现,SVF 辅助脂肪移植优于单纯脂肪移植,并且丰富的SVF 营造了一个能促进SVFs 存活和分化的微环境。Fu 等[46] 利用免疫荧光染色动态追踪SVF 细胞,证实移植的SVF 细胞可在缺血微环境中存活,分化为脂肪细胞,并可参与血管的形成。 日本学者吉村浩太郎提出CAL 概念,即细胞辅助脂肪移植(cell-assisted liportransfer),认为ADSCs 在CAL 中通过以下4 方面发挥作用:(1)分化为脂肪细胞,起到再生作用;(2)分化成内皮细胞和血管壁细胞等,促进血管再生,提高移植成活率;(3)可在缺氧条件下释放血管生长因子,诱导血管发生;(4)作为新生脂肪组织中的原始ADSCs,在脂肪组织凋亡时进行替代。而后国内外学者[47] 将VEGF 基因导入ASCs,通过ASCs 辅助脂肪移植。Suga 等[48] 采用蛋白质印迹法检测显示ASCs 移植组高表达干细胞生长因子(HGF)和血管内皮生长因子(VEGF),提示ASCs 能减少缺血脂肪垫中脂肪组织的萎缩;并且他证实,在严重缺氧时脂肪源性干/ 祖细胞仍然存活活跃,这有助于组织的修复。Tanikawa 等[49] 将ADSCs 加入到移植脂肪中发现在改善颅面短小患者的面部塑形中,该法优于传统的脂肪注射方法。据Butala 等[50] 研究显示:内源性祖细胞活化可以促进低密度脂肪新血管形成,增加促血管形成细胞因子的表达,改善移植存活能力至与高密度脂肪移植相当的水平。 虽然在脂肪移植物的存活和血管再生方面取得了突破,但基因治疗存在较大争议:(1)基因治疗的安全性、稳定性及可控性难以预测;(2)转入基因的长期表达是否会对体内其他器官产生负面影响尚不得而知;(3)基因治疗的实验室准备程序繁多,病毒转染成功率低,操作复杂,成本较高,难以推广。 (二)缓释技术 通过将生长因子包埋入缓释微球中可望大大延长其促血管化的作用时间,并且能为自体脂肪移植提供安全、可控、稳定的技术支持。该技术通过理化方法使小分子药物与高分子的载体结合,再通过扩散、渗透等控制方式,将小分子药物以适当的浓度持续释放出来,从而使药物有效而持久地发挥其生物效应。目前,药物缓释载体材料包括天然高分子材料和合成高分子材料。前者如壳聚糖、海藻酸钠、白蛋白、明胶、淀粉等,后者如聚碳酯、聚氨基酸、聚乳酸等。 其他缓释技术还有VEGF 复合SVFs 细胞疗法、微渗透泵、利用纤维蛋白胶支架与ASCs 复合后注射的可注射型组织工程支架等。 微球缓释技术联合促血管化生长因子应用于临床上软组织修复及脂肪填充等方面,仍存在一定局限性:(1)载体材料在制备过程中带入的杂质可能会引起人体的免疫应答,其生物相容性有待提高,可能导致移植物的炎症反应,从而影响移植物的存活率。(2)促血管生长因子长时间作用于局部组织是否会产生畸变,还有待临床试验观察。(3)在包含生长因子的缓释微球制备中,封包率、载药量及释药量等缺乏统一的标准,尚需要进一步研究与临床实践。 利益声明:本文作者与论文刊登的内容无利益关系。 参考文献 |
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