AAV的包装纯化浓缩方法总结

迷途中小小书童 2020-01-07

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腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）,也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。它编码两个末端的反向重复序列（ITR）中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白， rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。

重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

实验步骤

1、准备HEK 293T细胞：

提前一天分HEK 293T细胞，包装时细胞密度85%-90%且细胞分布均匀，状态良好(即：显微镜下观察，培养基中无杂质，无细胞悬浮或有少量细胞悬浮，细胞饱满，在培养皿中贴壁均匀)。

2、包装病毒

1）提前一到两个小时给细胞换液，换成无血清的DMEM培养基（1%HEPES和1%P/S）。换液时移液管要靠近培养皿内壁但不要贴住培养皿内壁缓慢加入DMEM，防止将已经贴壁的细胞吹起，同时换液时应注意避免移液管污染换液用培养基及细胞。

2）转染：以5个15cm培养皿的量为例：

向15ml离心管中依次加入DMEM:9ml，Helper:124μg，RC:76μg，目的质粒：65.1μg，PEI:1ml，振荡混匀后室温静置30min。

辅助质粒和目的质粒需要根据其浓度换算出所需的体积，在加入之前要振荡混匀。

3）将上述静置后的液体平均加到5盘HEK293T细胞中并做好标记，加入时同样要贴壁缓慢加入，避免将细胞吹起，加入后摇晃混匀（水平十字混匀）。将细胞至于37℃，5％CO2培养箱中培养。

4）观察转染效率：

转染后24h观察转染效率，一般为60%-70%左右，看看所需荧光是否正确。

3、收毒

1）将细胞吹起，连同培养基一并收到50ml离心管中，每5盘细胞收集到3个50ml离心管中，平均每管45ml, 3500rpm(2100g)常温离心7 min。

2）将培养基上清转移到新管中，PEG8000沉淀过夜（每100 mL加入2.33 g NaCl + 8.5 g PEG8000），第二天离心3500 g、4 ℃离心30 min，弃掉上清（离心后马上弃去上清，防止病毒回溶），用2 mlPBS+0.001%PF68 重悬。

3）将细胞沉淀用PBS+0.001%PF68 5 ml重悬，冻融一次后加入5M Nacl （高压灭菌）2 ml，涡旋混匀。

4）将2）的重悬液与3）的重悬液混合，振荡混匀后超声至不粘稠，超声时不同样品之间探头要依次经过84（用无菌水稀释10倍），75%酒精，灭菌水的清洗，超声30s停8~10s，根据样品的粘稠度不同AMPL30％超3-4次，AMPL20％超一次（用粗的探头）。转换超声强度是因为当用AMPL 30%超声3-4次不粘稠后，如果再用30%的强度超声一次可能会因强度过强对病毒活性有一定的影响，换用20% AMPL 超声一次可以使超声更加充分。

5）将超声后的液体3500 g、4 ℃ 离心30 min，将上清转移至新的离心管中。

4、纯化：碘克沙醇密度梯度离心

1）按如下的比例配置不同浓度的碘克沙醇。（用灭菌水配制60%碘克沙醇w/v,并用0.2μm的滤膜过滤至灭过菌的瓶中）

层数	60%碘克沙醇(ml)	5M Nacl (ml)	H₂O (ml)	2.5M KCl (μl)	1M MgCl2 (μl)		10×PBS (ml)	Total (ml)	每管用量（ml）
15%	25	20	45	100	100	10		100	9
25%	41.7	0	48.3	100	100	10		100	6
40%	66.7	0	23.3	100	100	10		100	5
60%	100	0	0	100	100	0		100	4.2

2）取一个超离管（超离管和盖子均高压灭菌后使用），逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60%层4.2 ml，再加入40%层5 ml，其次加入25%层6 ml，后加入15%层9 ml。加入不同浓度的碘克沙醇时要倾斜离心管并缓慢推入，避免串层，尤其是加入15%层时，由于浓度为15%与25%的碘克沙醇密度差距小，15%层很容易与25%层混合。整个操作需要在生物安全柜里进行。

3）将处理好的粗病毒液加入到上层，加入病毒时尤其开始要小心缓慢加入，切忌猛地将病毒推入至管中，并将管盖盖好。

4）超速离心: 离心前应将相对的超离管配平，误差控制在0.1 g以内（一般控制在0.02 g以内），转子选择VTi50 , 48000 rpm 4 ℃离心2.5 h。转速达到规定转速后才可离开，超速离心完成后将转子放至4 ℃冰箱。冬天温度过低或夏天温度高时，均应将空调打开升温或降温，冬天温度过低时，室温低于10 ℃时，超速离心机抽真空泵工作报错，夏天室温过高时，会使离心机运转时产生的热量难以散发影响离心机的正常运转。

5. 浓缩

1）离心完毕后，将超滤管底用10 ml注射器用的针头（单独订购的针头）刺破，弃掉滴下的前两毫升，收集第三毫升到第六或七毫升。使用过的针头需要用原来的针头盖盖好，并置于专门的装有84的瓶子中，集中丢弃，避免人员被针头刺到。

2）由于超声这一步及在用NaCl将和PEG8000沉淀上清中的病毒时，都有染菌的可能性，因此收集的四或五毫升液体需先用1X的双抗37℃处理1小时，用PBS+0.001%PF68稀释至15ml，用0.2μm的滤膜过滤，以达到除菌的目的。

3）将过滤后的液体置于15ml的超滤管(100 KD)中，3500 rcf, 4 ℃离心30 min。如果体积还不到理想体积，需要将离下去的液体弃掉，向超滤管中加入PBS+0.001%PF68稀释，再次离心。每次离心前均需将超滤管中液体颠倒混匀，配平后进行离心，相差0.1 g以内，尽量在0.02 g以内)。时间长短可以根据溶液的粘稠程度而定。（不论第一次凝缩离心后管中剩多少液体都应用PBS+0.001%PF68稀释后再离心一次，防止碘克沙醇及酚红残留过多）

4）将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，将一定体积的PBS+0.001%PF68加入至浓缩管中，反复吸打混匀后将液体吸出,一般情况下AAV浓缩离心完成后将剩余的液体吸出后用PBS+0.001%PF68 洗两次，每次用PBS+0.001%PF68 150μl左右，一般清洗时小体积为100μl,体积太小容易在反复吸打的过程中产生气泡影响病毒的收集，终在病毒收集管管壁标明名称和日期。即使离心后浓缩管中剩余的病毒体积与合同要求体积相近，也应用100μl的PBS+0.001%PF68清洗一遍。