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免疫沉淀步骤

 NJmerrybio 2020-01-10

实验方法:免疫沉淀法

实验所需主要器材:4℃离心机、透析袋、离心管、微量加样器、
实验所需主要试剂:透析液、蛋白A微球平衡液 、蛋白A微球、正常兔血清、兔多克隆抗体、PBS、甘氨酸洗脱液(pH 3.5 )
实验步骤:
(一)透析去除小分子物质
4℃条件下,将收集各管蛋白并入透析袋内,放入透析外液(含Na2HPO4、NaCl, pH 8.0)约300毫升,每3~4小时换浓度降低透析外液。最后将蛋白溶液装入离心管中,约6~8 ml.

(二)蛋白溶液的预处理
1、每1 ml 蛋白溶液加50 ul 正常兔血清或 IgG(浓度?)
2、冰上孵育2hr
3、平衡蛋白A 微球:将蛋白A 微球悬浮于洗脱缓冲液中,搅拌后10000g离心,弃洗液,置于冰上
4、将蛋白溶液与蛋白A微球混合
5、冰上30分钟,4000 g×3min,4 ℃离心。小心将上清移至另一试管中
(增加蛋白A的浓度,彻底去处用于预处理的非特异性抗体)

(三)免疫复合物的沉淀
1、预处理的蛋白溶液置于适当数量的1.5ml的管中(0.5ml/管),加入抗血清1ul作为起始用量(滴定抗体量:范围0.5ul~5ul)
2、冰上孵育2hr
3、加入100ul蛋白A微球(10%的悬液),4℃摇动1hr
4、10000g×15sec,4℃ 离心,收集微球,
5、将0.5倍体积的的PBS pH7.4 ,与沉淀混匀15min, 离心后弃上清。重复3次

(四)目的蛋白的洗脱
1、  将0.5倍体积的pH3.5的甘氨酸-盐酸洗脱液与沉淀复合物颠倒混匀15min ,离心收集上清
2、  重复2~3次,
3、  取各管 SDS-PAGE,鉴定组份

仅供参考

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