实验方法:免疫沉淀法 实验所需主要器材:4℃离心机、透析袋、离心管、微量加样器、 实验所需主要试剂:透析液、蛋白A微球平衡液 、蛋白A微球、正常兔血清、兔多克隆抗体、PBS、甘氨酸洗脱液(pH 3.5 ) 实验步骤: (一)透析去除小分子物质 4℃条件下,将收集各管蛋白并入透析袋内,放入透析外液(含Na2HPO4、NaCl, pH 8.0)约300毫升,每3~4小时换浓度降低透析外液。最后将蛋白溶液装入离心管中,约6~8 ml.
(二)蛋白溶液的预处理 1、每1 ml 蛋白溶液加50 ul 正常兔血清或 IgG(浓度?) 2、冰上孵育2hr 3、平衡蛋白A 微球:将蛋白A 微球悬浮于洗脱缓冲液中,搅拌后10000g离心,弃洗液,置于冰上 4、将蛋白溶液与蛋白A微球混合 5、冰上30分钟,4000 g×3min,4 ℃离心。小心将上清移至另一试管中 (增加蛋白A的浓度,彻底去处用于预处理的非特异性抗体)
(三)免疫复合物的沉淀 1、预处理的蛋白溶液置于适当数量的1.5ml的管中(0.5ml/管),加入抗血清1ul作为起始用量(滴定抗体量:范围0.5ul~5ul) 2、冰上孵育2hr 3、加入100ul蛋白A微球(10%的悬液),4℃摇动1hr 4、10000g×15sec,4℃ 离心,收集微球, 5、将0.5倍体积的的PBS pH7.4 ,与沉淀混匀15min, 离心后弃上清。重复3次
(四)目的蛋白的洗脱 1、 将0.5倍体积的pH3.5的甘氨酸-盐酸洗脱液与沉淀复合物颠倒混匀15min ,离心收集上清 2、 重复2~3次, 3、 取各管 SDS-PAGE,鉴定组份 仅供参考
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