微生物检定法测抗生素活性/效价

概述

由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。

微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。

琼脂扩散法，亦称管碟法。系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

2015版药典四部通则

1201 抗生素微生物检定法
    本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
    抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
    测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时，应调整其估计效价，重新试验。
    除另有规定外，本法的可信限率不得大于5％。
    第一法 管碟法
    本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
    菌悬液的制备
    枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液 取枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
    短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液 取短小芽孢杆菌（CMCC（B）63 202〕的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
    金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕或〔ATCC29 213〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
    藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌〔CMCC（B）28 001〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
    大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液 取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
    啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液 取啤酒酵母菌〔ATCC 9763〕的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于IV号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。
    肺炎克雷伯菌（Klebosiella pneumoniae）悬液 取肺炎克雷伯菌〔CMCC（B）46 117〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。
    支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）悬液 取支气管炎博德特菌〔CMCC（B）58 403〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在32～35℃培养24小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。
    标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。
    标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
    供试品溶液的制备 精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。
    双碟的制备 取直径约90mm，高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（表l）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃）加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径为6.0mm±0.1mm，高为10.0mm±0.1mm，外径为7.8mm±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。
    检定法
    二剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径（或面积），照生物检定统计法（通则1431）中的（2.2）法进行可靠性测验及效价计算。
    三剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度（S3）、中浓度（S2）及低浓度（S1）的标准品溶液，其余3个小管中分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为1：0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径（或面积），照生物检定统计法（通则1431）中的（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
    
    
    第二法 浊度法
    本法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。
    菌悬液制备
    金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
    大肠埃希蔺（Escherichia coli）悬液 取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
    白色念珠菌（Candida albicans）悬液 取白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕的改良马丁琼腊斜面的新鲜培养物，接种于10ml培养基IX中，置35～37℃培养8小时，再用培养基IX稀释至适宜浓度，备用。
    标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表3的规定进行稀释。
    标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
    供试品溶液的制备 精密称（或量）取供试品适量，照各品种项下规定进行供试品溶液的配制。
    
    
    含试验菌液体培养基的制备 临用前，取规定的试验菌悬液适量（35～37℃培养3～4小时后测定的吸光度在0.3～0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。
    已接种试验菌的液体培养基应立即使用。
    检定法
    标准曲线法 除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各品种项下规定的剂量-反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1：1.25或更小），供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量，每一剂量不少于3个试管。在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时），在线测定或取出立即加入甲醛溶液（1→3）0.5ml以终止微生物生长，在530mn或580mn波长处测定各管的吸光度。同时另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml，其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况的阳性对照，另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。照标准曲线法进行可靠性检验和效价计算。
    抗生素微生物检定法标准曲线法的计算及统计学检验
    标准曲线法的计算及可靠性检验
    1.标准曲线的计算
    将标准品的各浓度lg值及相对应的吸光度列成表4。
    
    2.回归系数的显著性测验
    判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。
    假设H0：b=0，在假设H0成立的条件下，按公式（4）～（6）计算t值。
    
    式中：yi为标准品的实际吸光度；
    Y为估计吸光度〔由标准曲线的直线回归方程（3）计算得到〕；
    y（平均）为标准品实际吸光度的均值；
    xi为抗生素标准品实际浓度lg值；
    x（平均）为抗生素标准品实际浓度lg值的均值。
    对于相应自由度（2n—4）给定的显著性水平α（通常α=0.05），査表得tα/2（n-2），若|t|>tα/2（n-2），则拒绝H0，认为回归效果显著，即X、Y具有直线回归关系；若|t|≤tα/2（n-2），则接受H0，认为回归效果不显著，即X、Y不具有直线回归关系。
    3.测定结果的计算及可信限率估计
    3.1 抗生素浓度lg值的计算 当回归系数具有显著意义时，测得供试品吸光度的均值后，根据标准曲线的直线回归方程（3），按方程（7）计算抗生素的浓度lg值。
    抗生素的浓度lg值：X0＝（Y0-a）/b           （7）
    3.2 抗生素浓度（或数学转换值）可信限的计算 按公式（4）和（8）计算得到的抗生素浓度lg值在95％置信水平（α=0.05）的可信限。
    X0的可信限：
    
    3.3 可信限率的计算 按公式（9）计算得到的抗生素浓度（或数学转换值）的可信限率。
    
    3.4 供试品含量的计算 将计算得到的抗生素浓度（将lg值转换为浓度）再乘以供试品的稀释度，即得供试品中抗生素的量。
    二剂量法或三剂量法 除另有规定外，取大小一致的已灭菌的试管，在各品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择适宜的高、（中、）低浓度，分别精密加入各浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml，二剂量的剂距为2：1或4：1，三剂量的剂距为1：0.8。同标准曲线法操作，每一浓度组不少于4个试管，按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。照生物检定统计法（通则1431）中的（2.2）法和（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
    培养基及其制备方法
    培养基I
    胨		5g	琼脂		15～20g
    牛肉浸出粉	3g	水 		1000ml
    磷酸氢二钾 3g
    除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
    培养基Ⅱ
    胨		6g	葡萄糖		1g
    牛肉浸出粉	1.5g	琼脂		15～20g
    酵母浸出粉	6g	水		1000ml
    除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
    培养基Ⅲ
    胨		5g	磷酸氢二钾	3.68g
    牛肉浸出粉	1.5g	磷酸二氢钾	1.32g
    酵母浸出粉	3g	葡萄糖		1g
    氯化钠		3.5g	水		1000ml
    除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
    培养基Ⅳ
    胨		10g	葡萄糖		10g
    氯化钠		10g	琼脂		20～30g
    枸橼酸钠	10g	水		1000ml
    除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
    培养基V
    胨		10g	琼脂		20～30g
    麦芽糖		40g	水		1000ml
    除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
    培养基Ⅵ
    胨		8g	酵母浸出粉	5g
    牛肉浸出粉	3g	磷酸二氢钾	1g
    氯化钠		45g	琼脂		15～20g
    磷酸氢二钾	3.3g	水		1000ml
    葡萄糖		2.5g
    除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。
    培养基Ⅶ
    胨		5g	枸橼酸钠	10g
    牛肉浸出粉	3g	琼脂		15～20g
    磷酸氢二钾	7g	水		1000ml
    磷酸二氢钾	3g
    除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
    培养基Ⅷ
    酵母浸出粉	1g	琼脂		15～20g
    硫酸铵		1g	磷酸盐缓冲液（pH6.0）1000ml
    葡萄糖		5g
    混合上述成分，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
    培养基Ⅸ
    蛋白胨		7.5g	氯化钠		5.0g
    酵母膏		2.0g	葡萄糖		10.0g
    牛肉浸出粉	1.0g	水		1000ml
    除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.5，在115℃灭菌30分钟。
    营养肉汤培养基
    胨		10g	肉浸液①	1000ml
    氯化钠		5g
    ①肉浸液也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代替 。
    取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，在115℃灭菌30分钟。
    营养琼脂培养基
    胨		10g	琼脂		15～20g
    氯化钠		5g	肉浸液①	1000ml
    除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
    改良马丁培养基
    胨		5.0g	酵母浸出粉	2.0g
    硫酸镁		0.5g	琼脂		15～20g
    磷酸氢二钾	1.0g	水		1000ml
    葡萄糖		20.0g
    除葡萄糖外，混合上述成分，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
    多黏菌素B用培养基
    蛋白胨		6.0g	酵母浸膏	3.0g
    牛肉浸膏	1.5g	琼脂		15～20g
    胰消化酪素	4.0g	水		1000ml
    葡萄糖		1.0g
    除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.7，在115℃灭菌30分钟。
    培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。
    灭菌缓冲液
    磷酸盐缓冲液（pH5.6） 取磷酸二氢钾9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.6，滤过，在115℃灭菌30分钟。
    磷酸盐缓冲液（pH6.0） 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
    磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
    磷酸盐缓冲液（pH7.8） 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
    磷酸盐缓冲液（pH10.5）取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钠溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。