灵芝的液体发酵与菌种制作

灵芝的液体发酵与菌种制作

来源：吉林省食药用菌信息网  | 发布时间：2014-4-29 |

1、  灵芝液体发酵培养又叫液体深层培养就是将灵芝菌接种在液体培养基中

给以充足的无菌空气、保持一定的温度使之生长液体发酵菌丝生长快完成一个生产周期只要1823天左右发酵罐周期只需46天。发酵产物有菌丝体和发酵液。发酵液中有大量的灵芝菌丝分泌物菌丝体和发酵液二者都有药用价值。 液体深层发酵培养的过程如下 斜面试管菌种→摇瓶通气培养→种子罐培养→发酵罐培养→发酵产物收集。 灵芝液体发酵培养菌丝生长快一般在45天就可完成一次发酵。液体发酵时由於所用培养原料都为速效养分又不断搅拌所以一旦感染杂菌就会马上大量繁殖从而造成发酵失败所以无菌操作要求特别严格。

要在无菌状态下 ， 液体深层培养对培养基要求 ：

1. 液体发酵培养需要速效的配伍培养基适当的pH、温度和通风条件。

2. 液体深层发酵培养需要碳源养分、氮源养分和微量元素养分。

3. 灵芝深层发酵所需要的碳源养分有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉等其中最好利用的是葡萄糖。

4. 葡萄糖、麦芽糖、蔗糖是小分子糖培养基中用量过高时会使渗透压提高从而会使菌丝内的水分外渗造成生理缺水而生长不出或不能生长。

5. 淀粉是一种大分子的物质在水溶液不易形成高渗现象所以用玉米粉或淀粉做碳源养分时淀粉用量可提高可达到56左右。

6. 氮源是构成细胞的主要物质液体发酵通常用的氮源物资有玉米浆、玉米粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵粉等。

7. 灵芝深层培养需要的金属元素主要是P、K、Mg、Ca、Zn、S等元素的无机盐其中对P、K、Mg的需要量最多。

8. 除P元素外灵芝对这些金属元素的要求只要培养基总量的百万分之几即可。由於需要量甚微一般天然培养基中所含有的微量元素已足够其生长之用。

灵芝深层发酵对酸碱度的要求 ：

1. 灵芝液体深层发酵最适宜的酸碱度为pH4.56过酸过碱对菌丝生长都不利pH值过低菌丝粗菌丝短生长慢pH值过高菌丝细弱菌丝可用率低。

2. 灵芝菌丝在生长过程中会产生酸性物质会使培养基pH下降当pH降至3.5以下时菌丝就不会生长。菌丝亦会开始自溶菌丝自溶后培养基pH就会上升所以在发酵时若测定结果pH有突然明显上升趋势时就可能是菌丝已开始自溶。

3. 由於发酵过程中培养基pH值会发生变化所以在发酵时每隔一定时间〈一般为78小时〉就要测pH值当培养基pH值急剧下降菌丝生长不良时就要用氨水或碱液调节培养pH。 pH值对灵芝菌丝生长的影响参考值 pH值〈灭菌后〉 菌丝密度 菌丝乾重〈〉终点pH 2.8 3.6 4.2 4.8 5.2 5.6 6.0 6.6 7.2 9.0 —— —— 0 0.65 0.67 0.76 1.10 1.20 1.18 0.67 0.65 —— —— —— 3.8 3.8 3.9 4.6 4.6 5.4 6.2 —— 3

灵芝深层发酵的温度条件 ：

1. 灵芝深层发酵的适宜温度为2530℃。发酵时必须给以最适当的温度条件高於30℃时菌丝生长快但菌丝得率低且容易自溶发酵液的色泽深高於36℃时灵芝菌丝停止生长40℃以上时菌丝很快死亡。

2. 发酵温度会对发酵产物积累发生影响温度高菌丝呼吸强度大营养物质的消耗量多发酵产物累积少温度低菌丝生长慢营养物质的消耗少发酵代谢物多但温度低发酵周期就会延长成本就会提高。所以发酵时前期以菌丝生长为主要阶段温度可控制在2728℃左右最佳以后当到代谢产物累积阶段时培养温度应降到20℃左右最佳。

通气

1. 深层发酵培养时菌丝生长快所以对氧的需要量非常之高在开始1118小时内若发酵液中氧含量不能满足灵芝菌丝生长的需要将会严重影响菌丝生长。

2. 但在发酵初期发酵液中菌丝量少所以需氧量也可少些菌丝进入旺盛生长期时需要的氧量就增加这时发酵罐通气量应控制到约0.51〈v/v min〉即每一立方米的发酵液中每分钟应通入无菌纯净空气约0.51立方米。

3. 发酵后期菌丝衰老代谢能力下降呼吸量也降低所以通气量可适当减少。

4. 通气发酵培养时要不断的搅拌搅拌能使氧气均匀的分布在发酵液中通过搅拌发酵液中可溶解更多的氧气菌丝分布也均匀但搅拌速度不能太快搅拌速度太快菌丝容易产生损伤。

接种量和菌龄：

1>  液体深层发酵培养时菌丝生长速度与接种量有关接种量多菌丝生长快杂菌感染率低但菌丝老化快接种量少菌丝生长慢菌丝老化也慢但若在较长时间中发酵液中没有足够的灵芝菌丝时抗菌性就会降低所以接种量过少时容易感染杂菌。

发酵用的菌种必须菌龄短、生命力旺盛、生长速度快这样发酵周期短经济效益高同时菌种生命力强抗杂菌能力也强。菌龄老、生命力弱、生长速度慢也容易感染杂菌。 灵芝深层培养的发酵技术 1生产流程 摇瓶培养基制备→灭菌→培养基→灭菌→斜面菌种→接种→摇瓶培养→种子槽发酵→发酵槽发酵→放缸→菌丝和发酵液分离→分别烘乾→培养基配制→灭菌→磨粉直接应用或提取→成品

2>  斜面菌种制备 液体发酵用的斜面菌种必须生命力强菌龄期要短接种后能迅速生长否则就会感染杂菌斜面菌种以菌龄1014天刚长满试管的为宜。 斜面菌种培养基 斜面菌种培养基配方种类很多不一定局限哪一种。

常用的培养基有：

a. PDA斜面培养基 马铃薯 200250g 葡萄糖 20 25g 琼脂 2025g 水 1000ml 自然pH 制法马铃薯去皮、切成薄片称取200g加水1000ml煮沸1520分钟左右到薯片酥而不烂止取滤汁加琼脂继续煮待琼脂全部溶解再加葡萄糖20g搅拌使全部溶解再补充水至1000ml装入试管装量为试管高度的1/51/4塞上棉塞1.05kg蒸气压保持2025分钟灭菌摆成斜面即可。

b.PDA综合培养基 马铃薯 200250g 葡萄糖 20 50g 硫酸镁 0.2 g 磷酸二氢钾 0.5 g 琼脂 2050 g 水 1000ml 自然pH 制法与PDA培养基同

c.玉米粉葡萄糖培养基 玉米粉 2025g 葡萄糖 1520g 琼脂 2025g 水 1000ml 自然pH 制法玉米粉40克加水1000ml煮沸保持3035分钟不断搅拌然后用密及纱布过滤取滤液以下与PDA培养基制法同。然后灭菌制成斜面。

3>  摇瓶菌培养 培养基 玉米粉 1 葡萄糖 3 酵母粉 0.5 磷酸二氢钾 0.2 硫酸镁 0.1 自然PH 制法玉米粉加些许的水均匀的搅拌加热至微沸保持1hr取过滤液再加入其他成分并补充水至1000ml搅拌分装於500ml约三角瓶中每瓶装200ml用密及的纱布包口包上不透气纸灭菌锅1.05kg蒸气压〈121℃〉3035分钟灭菌。

4>  接种方法 在无菌箱或接种室中用接种针挑取试管表面菌种并将其割碎接入灭菌的三角瓶培养基中每管接1瓶2428℃摇瓶培养摇瓶速度每180次/分培养57天当培养液呈清澈透明状培养液中充满菌球时即可终止摇瓶作菌种发酵灌接种用。 摇瓶菌种质量作为优劣的鉴别。 摇瓶菌种质量的好坏对发酵有密切关系优良的摇瓶菌种接种后菌丝生长迅速不易感染杂菌。

优良的摇瓶菌种应该是：

1. pH.45。

2.菌球细小、中实、无黑、发酵液稍有粘稠、菌丝分枝密度高、可见芽头和锁状联合、细胞内充满原生质和空泡。

3.菌丝球湿重应达发酵液重1018。

4.发酵液清澈透明有灵芝发酵液特有的香味。

5.显微镜检查下无杂菌。

5>  菌种发酵灌培养 培养基 玉米粉 23 蔗糖 23 葡萄糖 12 磷酸二氢钾 0.2 硫酸镁 0.1 酵母粉 0.2 自然pH 每100L菌种发酵灌培养液〈基〉6065L。 玉米粉处理和摇瓶培养方法相同。

培养条件如下：

接种量1015搅拌速度220r/分通气量l1.051.1〈v/v/分〉。缸压0.40.5公斤/平方公分、温度2628℃培养时间7284hr。菌种发酵灌有一级和二级之分一级菌种发酵灌60100L二级菌种发酵灌500L二级菌种发酵灌接种量1014发酵条件与一级菌种发酵灌同培养时间7072hr。

6>  菌种发酵质量标准与摇瓶培养相同

a.发酵灌培养 发酵灌培养目的是为了获得尽可能多的灵芝菌丝体及代谢产物培养时间短。发酵灌培养时接种量512发酵灌体积大一般应达15KL以上人的发酵灌可达2030KL发酵时间72hr左右。 培养基 蔗糖45玉米粉23酵母粉0.2磷酸二氢钾0.1硫酸镁0.075豆油适量。灭菌前pH6.5左右。发酵条件与种子培养相同。 放灌标准 菌丝无明显芽头和锁状联合菌丝变细菌丝原生质聚集少数菌丝已开始自溶菌丝含量应达培养基重量1532pH33.5。

b.发酵过程灵芝菌丝形态变化 灵芝发酵过程每812hr应取少量发酵液观察最初阶段菌丝细胞内原生质著生较深以后逐渐变浅原生质从分布均匀到凝聚从开始有明显锁状联合到后期菌丝锁状联合不明显后期部分菌丝出现自溶。

c.放灌后发酵液处理。 发酵液放出灌离心或板框压滤将滤液和菌丝分开分别烘乾磨粉。菌丝体粉和发酵液可直接制作药品或保健食品也可再进一步作提取多醣应用。灵芝菌丝体和发酵液可单独也可合并应用。灵芝菌丝体和发酵液萃取多醣方法与子实体萃取多醣方法相同。

d、灵芝深层发酵培养中杂菌感染和防治办法。 灵芝深层发酵培养需要在无菌的条件下著手。因为培养液中营养成分很丰富且在不断搅拌所以一旦感染杂菌整灌菌种即会遭到污染所以一旦感染杂菌应会造成发酵失败因此深层发酵必须做好杂菌防治工作。

灵芝深层发酵培养杂菌感染的环节相当之多包括菌种带杂菌设备密封或培养基灭菌不彻底接种操作不谨慎等等。

防治杂菌污染必须做好下列工作：

1 试管菌种一定要纯接种前要放在灯下仔细检查不得有疑是任何杂菌现象。

2 菌种的年龄要短生命力要强要有一定接种量在发酵灌中生长迅速灵芝菌丝占优势后杂菌即不感染。

3 培养基原料要新鲜不能有霉变彻底灭菌培养基中不可有任何杂物。

4 设备要经常检修、阀门、管道接种口密封严不能有渗漏情形发生。

5 空气过滤器内不能受潮发酵通气时过滤器内要始终保持正压状态否则培养基会因为流到过滤器内使过滤器内受潮此时就必须及时更换内芯。

6 接种操作要细心做好无菌操作。

7 发酵时防止发生泡沫冒顶。

8 随时取样检验观察发酵液的色泽和透明度、气味发酵结束时发酵液应清澈、透明有特殊清香味无霉味、酒味和臭味若发现杂菌感染应立即放灌寻找污原因。

7>  发酵液杂菌检验方法 杂菌检查一是用肉眼观察发酵液色泽是否有气泡二是闻气味有否异味。但最主要的是进行菌检在无菌培养条件下观察有否杂菌生长。

a.肉汤酚红培养基的检验方法 培养基 牛肉膏 34g 蛋白腖 1012g 葡萄糖 34g 氯化钠 56g 酚红溶液 23ml 水 1000ml 灭菌条件 1.05kg/平方公分×30min pH 7.07.5〈灭菌前〉 杂菌污染鉴别 发酵液接入培养基内培养24hr培养24hr若色泽由红变黄培养基混浊则有受感染。酚红1ml用95浓度乙醇15ml溶解再加85ml蒸馏水。

b.牛肉膏葡萄糖平板培养基检验方法 牛肉膏 34g 葡萄糖 34g 蛋白腖 1012g 氯化钠 56g 琼脂 2025g 蒸馏水 1000ml pH 7.27.7〈灭菌前〉 灭菌条件 1.05kg/平方公分×30min 培养基灭菌后倒於培养皿中平置使培养基成一平面。在无菌条件下将发酵液接种在平板培养基上2730℃培养48hr。 若平板上出现无菌丝样菌落菌落边缘光滑菌落呈半透明状或腊脂状或粗糙有皱褶即表示有酵母污染。 若菌落呈菌丝状色泽多样即为霉菌污染。

灵芝发酵液菌丝体含量测定取发酵液100ml用40mesh筛子过滤去滤液滤取物用水反覆冲洗再用砂芯漏斗真空过滤滤取物在6065℃烘箱中烘乾恒重、称量计算其乾菌丝体的得率发酵良好乾菌丝体得率应达1.51.8以上。

灵芝菌种的退化和复壮：

1. 灵芝菌种经过若干次的接种栽培后若平时不注意选优会呈现菌丝稀疏即是退化现象而且菌丝丛中出现褐色无菌丝的斑块前端菌丝参差不齐、灵芝子实体产量低、小、开片迟、畸形等现象。

2. 退化原因接种时菌丝受到机械损伤菌丝老化自然退化退化后菌丝酶活性下降或者是受到病毒感染。

3. 菌种复壮菌种发生退化后必须进行复壮。 复壮乃是从原来菌种培养的子实体中选取生长势强、产量高的子实体重新进行组织分离分离得到新的菌种且菌丝生长迅速生长整齐长满菌丝的菌种瓶壁处没有菌斑出现栽培后产量、质量达到原来菌种指标的则是菌种已得到复壮。

4. 菌种所以能够复壮是因为原来菌种的各部份菌丝的退化不是同步的而是二级菌丝〈丝状菌丝〉在变为三级菌丝〈子实体组织菌丝〉时其菌丝有一个变化的过程菌丝细胞内生殖菌丝细胞器多、大、生命力强所以有可能获得生命力强的菌种。

5. 菌种复壮时从子实体上所分离获得的菌种不会全部都是优良的菌种所以一次分离菌种必须有一定的数量至少达10个左右从较多新分离的菌种中通过栽培比较才能得到比较好的菌种有时需要从几次分离的大量的菌种才能得到一个好的理想的菌种。