【原】DNA复制的起始机制

复制子模型的提出者，弗朗索瓦·雅各布（Francois Jacob）是法国细菌遗传学家，分子生物学奠基人之一。他最重要的贡献是提出操纵子模型，为此荣获1965年诺贝尔生理学或医学奖。

弗朗索瓦·雅各布。引自诺贝尔基金会档案

虽然不同生物中的复制基因和起始蛋白等会有很大差异，但DNA复制的起始过程都符合识别复制起点-加载解旋酶-组装复制体这个基本程序。

复制起点的识别由起始蛋白负责。细菌的起始蛋白是DnaA，含有HTH（螺旋-转角-螺旋）DNA结合结构域和AAA +（与多种细胞活性相关的ATPase）结构域。与之相应，复制起点（oriC）中含有多个DnaA box，可以被HTH结构域识别并结合。DUE是DNA解链元件（DNA unwinding element），富含AT，易于打开双螺旋结构。DnaA-trios是三联体重复序列，可与DnaA的AAA +结构域相互作用，有助于解链。

细菌的复制起点识别。PLoS Genet. 2019

对于DnaA与oriC相互作用的具体过程，目前有不同的模型，如two-state model与loop-back model。总之，二者的相互作用使DUE区解链，然后才能将解旋酶（DnaB）募集到单链DNA上，进入第二阶段。

真核生物的起始蛋白是起点识别复合物（ORC），由6个亚基（Orc1-6）构成。此外，还有辅助因子Cdc6和Cdt1。复合物中具有类似原核起始蛋白的AAA+与WH（winged helix，有翼螺旋）结构域，后者具有DNA结合功能。

不同物种的ORC结构。Curr Opin Struct Biol. 2018

真核生物的复制起点称为自主复制序列（ARS），其中包含一个保守的ARS共识序列ACS。ORC通过AAA +域的起始蛋白特异性基序（ISM）与DNA的磷酸核糖骨架结合，WH域通过一个进入DNA大沟的β-发夹motif结合DNA。这些作用在DNA离开ORC的中央通道时使其弯曲，有助于解旋酶Mcm2-7的装载。

ORC与真核复制起点的识别。Curr Opin Struct Biol. 2019

在DNA复制过程中解开双螺旋结构的酶称为复制解旋酶（replicative helicase），本文中简称为解旋酶。它通过ATP水解提供能量，断裂双链间的氢键。原核生物的解旋酶是DnaB，真核生物是Mcm2-7（minichromosome maintenance protein，微染色体维持蛋白）复合物。

两类解旋酶都由两个六聚体环构成，DNA从环中穿过。解旋酶结合到DNA上的过程称为加载（load）。原核生物的解旋酶是以活性形式加载的，结合在单链DNA上；真核解旋酶以非活性形式加载到双链DNA上，要下一阶段才会被激活。

原核与真核生物的解旋酶加载。Nucleus. 2016

在G1期的早期，ORC将CDC6和CDT1募集到复制起点，随后加载MCM2-7，再将CDC6和CDT1从染色质中释放出来，以防止MCM2-7重新加载，保证每个细胞周期只复制一次。在S期， CDC45和DNA复制复合物Go-Ichi-Ni-San（GINS）与MCM2-7六聚体结合形成CDC45 / MCM2-7 / GINS（CMG）复合物，激活MCM的解旋酶活性。

真核生物中DNA复制的起始。Crit Rev Biochem Mol Biol. 2017

在复制过程中需要用到很多蛋白，它们组合成一个庞大、复杂的复合体，称为复制体。复制体的核心是解旋酶，沿着单链DNA（ssDNA）移动，不断解开双链。

病毒、细菌与真核生物的复制体。Biophys Rev. 2019

新生的ssDNA需要与某种蛋白结合，以防重新生成双链或降解等。这种蛋白在细菌中称为单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB），在T7噬菌体中称为基因产物2.5（gene product 2.5，gp2.5），在真核生物中称为复制蛋白A（replication protein A，RPA）。有时也将其统称为SSB。

除了保护ssDNA外，SSB还可以发挥重要的调控作用。例如在复制叉因意外而停滞时，RPA会被磷酸化，然后募集修复因子，从而稳定复制叉。这种机制的异常会导致复制叉容易崩溃，增加突变率。

RPA磷酸化保护复制叉稳定性。J Cell Biol. 2014

Primase是引发酶，用于合成RNA引物。T7噬菌体的引发酶是gp4，引物由2-4个核糖核苷酸组成。大肠杆菌引发酶是DnaG，合成26–29 个核苷酸的RNA引物。

真核生物的引物约9-11个核苷酸，引发酶由DNA聚合酶α（Polα）“兼任”。Polα是高度保守的异四聚体复合物，具有两个催化活性：最小的p48亚基（Pri1）中的具有primase活性，最大的p180亚基（Pol1）具有聚合酶活性，另外两个亚基是调节亚基。关于各种聚合酶的具体作用将在下一篇文章讨论。

增殖细胞核抗原（PCNA）最初被称为DNA滑动夹（DNA sliding clamp），认为它的作用是提高聚合酶的效率。随后的研究表明，它可与多种分子相互作用，从而参与多种代谢途径，包括DNA的复制与修复、DNA甲基化、染色质重塑和细胞周期调控等。

PCNA介导聚合酶转换绕过复制障碍。Biophys Rev. 2019

Langston等人提出了一种机制，解释复制体如何绕过模板上的障碍进行复制。在此途径中，遇到障碍的Polε会失速并与DNA和PCNA解离，PCNA募集低保真的竞争性跨障碍合成（TLS）聚合酶，从而合成跨障碍的核苷酸。同时，Polε通过与GINS相互作用保留在复制叉上，通过障碍后再替换TLS聚合酶，继续正常复制。

参考文献：

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