基于干细胞片的神经导管有效促进脊髓损伤修复

脊髓损伤（SCI）会对脊髓神经元结构和功能产生毁灭性伤害，导致患者在受损点以下运动和感觉功能丧失，使患者遭受巨大的经济负担和无尽的痛苦。 SCI可分为两个阶段：原发性和继发性损伤。原发性损伤的原因是机械损伤后脊髓及其周围血管组织的破坏导致局部水肿、缺血和缺氧。继发性损伤的主要诱因是原发性损伤引起的局部缺血和缺氧，从而引起炎症细胞浸润以及神经元凋亡和坏死。因此，缺血和缺氧有可能加重病理过程并阻碍SCI的恢复。

针对脊髓受损区域周围剩余神经元再生能力有限的问题，目前已使用各种来源干细胞进行SCI修复。其中，间充质干细胞（MSCs）易于分离，培养潜力高，可进行多系分化而得到关注，更重要的是，MSC具有极低的免疫反应性或无免疫反应。目前，在支架材料中进行MSC注射和MSC接种是两种常用的方法，其缺点是支架材料的接种密度低，细胞损失和免疫原性低，限制了它们在SCI修复中的应用。

细胞片层技术是组织工程中的一个创新技术。由细胞和细胞外基质组成的完整连续的细胞片无需酶解即可获得，这使细胞的生物活性得以完全保持，有效地避免了生物材料的不利影响。此外，细胞片具有很好的粘附能力，可以不使用任何缝线进行移植或移植到宿主组织。因此，细胞片被广泛应用于皮肤、肝脏、心脏、角膜、牙周组织等各种组织的修复。然而目前仅有少数研究报道其在神经元修复中的应用，由此探讨干细胞片对脊髓损伤的修复作用是非常迫切和必要的。

最近，为了解决脊髓损伤修复过程中缺血缺氧以及受损区域剩余神经元有限的再生能力等问题,兰州大学口腔医学院范增杰教授团队和甘肃科学院传感技术研究所的Yingying Nie教授团队利用细胞片层技术将两种不同的细胞(MSCs 和内皮细胞ECs)共培养获得预血管化的细胞片，然后将细胞片卷曲后再培养获得预血管化的神经导管（PNC），将其植入大鼠横切SCI中，以未血管化的神经导管（NPNC）为对照组评估其愈合效果（图1）。

Fig. 1. Schematic illustration of the preparations of prevascularized cell sheet, PNC, SCI model, and the implantation of PNC into the SCI rat.

如图2所示，培养14天后兔来源的MSCs形成了完整且连续的细胞片（图2a），然后接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养7天形成预血管化的细胞片（图2b），使用镊子可以轻松地将其从培养皿的表面提起。将其轧制成管状结构并再培养7天后，可将细胞片从PTFE中取出（图2c和2d）并保持完整（图2e和2f）。NPNC和PNC的SEM图像如图3所示。NPNC细胞片表面光滑，被大量ECM包围，而PNC细胞片表面粗糙，有许多微囊样结构，可能表明微血管网络的形成。

Fig. 2. Photographs of MSC cell sheet (a); prevascularized MSC cell sheet (b); rolling into NPNC based on MSC cell sheet (c); rolling into PNC based on prevascularized MSC cell sheet (d); NPNC based on MSC cell sheet after removal from the PTFE model (e); PNC based on the prevascularized MSC cell sheet after removal from the PTFE model (f).

Fig. 3. SEM images of NPNC (a and c) and PNC (b and d) at different magnifications, and the cross profile images of NPNC (e) and PNC (f).

研究者进行了免疫组织化学染色，进一步证明了细胞片的融合和血管的形成（图4）。NPNC组和PNC组之间的Ⅰ型胶原蛋白表达几乎相同，而PNC组中纤连蛋白的表达高于NPNC组。此外，在形成预血管化细胞片后，Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的排列变得更加有序（图4b和d）。NPNC组CD 31染色为阴性，而PNC组为阳性，样品中出现了多个带有微血管样图案的管腔（图4f）。

Fig. 4. Immunofluorescence images stainedwith Collagen I (a, NPNC; b, PNC), Fibronectin (c, NPNC; d, PNC), and CD31 (e,NPNC; f, PNC). The white lines denote the ordered arrangement of relatedproteins. The white circles denote the microvessel (scale bar = 200 μm). (Forinterpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

然后研究者将NPNC和PNC组植入SD大鼠脊髓损伤区，观察其在体内的愈合效果。采用BBB评分量化SCI的修复效率。研究者发现PNC组BBB评分(图5)高于对照组，PNC组与对照组在4周内无统计学差异。从第4周开始，PNC组的BBB评分远远高于NPNC组和对照组，说明PNC可以加速SCI的修复过程。

Fig. 5. BBB scores: BBB scores of the control group, NPNC group, and PNC group (∗ : P < 0.05 vs. blank group).

H&E染色结果（图6）表明，与对照组和NPNC组相比，PNC组无明显萎缩，炎性细胞浸润损伤区较少。此外，对缺损部位进行局部观察（图7）发现，在第2周时，对照组修复区周围的神经元相对较少，而NPNC和PNC组中修复区含有较多神经元，这可能是体内诱导的MSC分化所致，且PNC组可以观察到更多的神经纤维，神经纤维较其他两组更厚、更长、更有序。

Fig. 6. Light microscopic images of H&E staining. a, Control group at 2 weeks; b, NPNC group at 2 weeks; c, PNC group at 2 weeks; d, Control group at 8 weeks; e, NPNC group at 8 weeks; f, PNC groupat 8 weeks (scale bar = 100 μm).

Fig. 7. H&E staining images of the injured site. a, Control group at 2 weeks; b, NPNC group at 2 weeks; c, PNC group at 2 weeks; d, Control group at 8 weeks; e,NPNC group at 8 weeks; f, PNC group at 8 weeks. A, denotes the astrocyte; F, denotes the neuron; N, denotes the neuron fibers; V, denotes the vacuole (scale bar = 200 μm). (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

本研究由兰州大学口腔医学院范增杰教授团队和甘肃科学院传感技术研究所的Yingying Nie教授团队合作完成，并于2019年10月31日在线发表于Acta Biomaterialia。

论文信息：Zengjie Fan*, Xiaozhu Liao, Yu Tian, Xie xuzhuzi , Yingying Nie*. A prevascularized nerve conduit based on a stem cell sheet effectively promotes the repair of transected spinal cord injury. Acta Biomaterialia In press.

供稿：余颖康

审校：朱彩虹

编辑：丁路光