编者按： 脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是导致严重神经功能障碍的最常见的中枢神经系统损伤之一，且发病率高。目前，这种疾病的确切致病机制尚不清楚，临床上治疗 SCI 及其后遗症的方法很多，但均未取得满意的疗效。因此，脊髓损伤后的神经修复仍然是医学界急需解决的重大挑战和临床难题。已有的研究表明，间充质干细胞（MSC）移植可能是一种有效的治疗脊髓损伤的方法，但具体的治疗分子机制尚不清楚。
近期，山东大学附属山东省立医院脊柱外科的王大川主任团队，分别在知名期刊：《Biomedicine & Pharmacotherapy》《Drug Design, Development and Therapy》陆续刊登了两篇研究文章，利用 SCI 大鼠模型全面揭示了间充质干细胞缓解大鼠脊髓损伤的分子机制，为后期开发新的 SCI 治疗策略，改善脊髓损伤后的功能恢复提供重要的理论支撑。定量蛋白质组学服务由诺禾致源提供。
其中，发表在期刊Biomedicine & Pharmacotherapy上的研究“Mesenchymal stem cell derived EVs mediate neuroprotection after spinal cord injury in rats via the microRNA-21-5p/FasL gene axis”，发现间充质干细胞衍生的胞外囊泡（MSCs-EVs）能显著改善 SCI 后大鼠的功能恢复，减轻损伤面积和细胞凋亡，并证明 MSCs-EVs 的神经保护作用是通过 miR-21-5p 来实现的。这一发现不仅为 miR-21-5p 分子机制的研究提供了新的、重要的见解，而且为 SCI 治疗干预新途径的发展奠定了基础。
将大鼠随机分为3组：假手术组（Sham）、SCI 组和 SCI+MSCs-EVs 组，研究脊髓损伤72h后MSCs-EVs的作用。BBB（Basso, Beattie, Bresnahan scores）评分显示，SCI 后大鼠即刻出现右后肢运动功能丧失，且恢复缓慢。从 SCI 后7天开始，MSCs-EVs 组的 BBB 评分开始显著高于 SCI 组，且随着时间的延长而进一步分离（图1A）。与 SCI 组相比，SCI+MSCs-EVs 组凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 的比值（Bax/Bcl-2）也显著降低（图1C,D）。表明 MSCs-EVs 可以在 SCI 后改善运动功能及抑制细胞凋亡。
图1 MSCs-EVs 改善运动功能及抑制细胞凋亡
2、利用 TMT 定量蛋白质组学筛选差异表达蛋白 利用 TMT 定量蛋白质组学比较 SCI 组和 SCI+MSCs-EVs 组蛋白表达变化。共鉴定到883种蛋白质，其中72种在 SCI 组和 SCI+MSCs-EVs 组之间呈现显著差异。差异蛋白以火山图（图2A）和聚类热图（图2B）的形式呈现，并使用 GO、KEGG 和 COG 等数据库对鉴定的蛋白质进行功能注释，从而了解这些差异蛋白质的功能特性。研究发现部分差异蛋白质与 SCI 显著相关，如凋亡（Programmed cell death 6-interacting protein, Bcl2-associated athanogene-4）和炎症（Annexin A1, Neutrophil antibiotic peptide NP-4）相关的蛋白。此结果与以前的研究一致，证明 MSCs-EVs 在脊髓修复中减轻炎症并发挥抗细胞凋亡作用（图2C）。
图2 差异表达蛋白分析
3、miR-21-5p 在 MSCs-EVs 及 SCI 后损伤脊髓组织中的表达分析利用 qRT-PCR 初步检测 miR-21-5p 在 SCI 后脊髓中的表达，发现 miR-21-5p 在 SCI 后4h 和12h 显著降低，SCI 后24 h、3d 和7d 显著升高（图3A）。miR-21-5p 是 MSCs-EVs 中表达最高的 miRNA 之一，与文献报道一致（图3B）。本研究利用 miR-21-5p 抑制剂及其阴性对照证实 miR-21-5p 抑制剂显著降低 MSCs-EVs 和损伤脊髓中 miR-21-5p 的表达（图3C,D）。表明 miR-21-5p 抑制剂的转染成功地降低了 miR-21-5p 在 MSC-EVs 中的表达水平，促进了 SCI 的发生。
图3 miR-21-5p 在 MSCs-EVs 及 SCI 后组织中的表达分析
4、EVs-miR-21-5p 下调促凋亡靶基因 FasL 的表达利用 miRNA 靶点分析工具（Targetscan和miBase）确定 miR-21-5p 介导神经元凋亡的潜在靶点。发现 miR-21-5p 与 FasL 基因的 3′UTR 具有互补性结合位点（图4A）。使用荧光素酶报告基因分析 miR-21-5p 和 FasL 基因之间存在直接相互作用，发现 FasL 野生型基因是 miR-21-5p 的直接靶基因（图4B）。SCI 后， FasL 基因表达明显升高，特别是12h（图4C）。而 MSCs-EVs 处理后，FasL 基因表达会降低，但用 EVs-miR-21-5pinhibitors 处理则可以逆转这种影响（图4D），表明 EVs-miR-21-5p 下调促凋亡靶基因 FasL 的表达。
图4 FasL 是 miR-21-5p 的靶基因
本文通过对大鼠 SCI 模型进行研究，发现 MSCs-EVs 能显著改善 SCI 后大鼠的功能恢复，减轻损伤面积和细胞凋亡。利用定量蛋白质组学证明 MSCs-EVs 在脊髓修复中具有减轻炎症并发挥抗凋亡作用。同时表明 MSC-21-5p/FasL 基因轴的调控可作为脊髓损伤及其他神经系统疾病的临床治疗策略，为相关疾病的干预新途径的发展奠定了基础。 干细胞移植被认为是具有广泛应用前景的 SCI 治疗手段，而旁分泌作用似乎是干细胞移植治疗 SCI 的主要作用之一。上篇研究证明了 MSCs-EVs 能显著改善 SCI 大鼠的功能恢复，那么，在各种疾病模型中发挥重要保护作用的外泌体（Exo）又会对 SCI 起到怎样的治疗效果呢？另一篇发表在期刊 Drug Design,Development and Therapy 上的文章题为：“Exosomes Derived From Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Inhibit Complement Activation In Rats With Spinal Cord Injury”，以大鼠 SCI 模型（假手术组（Sham）、SCI 组和 SCI+Exo（Exosomes）组）为研究对象，利用定量蛋白质组等技术，深入探讨了骨髓间充质干细胞外泌体（BMSCs-Exo）作为无细胞疗法对大鼠 SCI 的作用机制。证明了 BMSCs-Exo 通过抑制补体 mRNA 合成和释放，以及与小胶质细胞结合抑制 SCI 激活的 NF-κB，在脊髓损伤中发挥保护作用，揭示了 BMSCs-Exo 缓解脊髓损伤的分子机理，有助于后期相应诊疗方法的开发。
KEGG 分析显示，Sham 组、SCI 组和 SCI+Exo 组在补体蛋白富集方面存在显著差异（图1）。SCI 组和 Sham 组间共鉴定到24个上调蛋白，这些上调蛋白主要为补体因子（Cfh、Cfp、 Cfb、C5、C6等），导致 SCI 组补体系统激活。与 SCI 组相比，SCI+Exo 组中发现7种下调蛋白，大鼠表现出下调补体系统某些成分的能力，导致补体系统抑制。表明 BMSCs-Exo 可以抑制 SCI 大鼠的补体系统激活。
图1 KEGG 通路图
2、BMSCs-Exo 减弱 SCI 诱导的补体 mRNA 表达增加用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测补体 mRNA 的表达，证实补体系统中有8种蛋白质的相应基因（图2A）。与 Sham 组相比，SCI 组的补体 mRNA 显著上调表达，而 BMSCs-Exo 处理后，SCI 诱导的补体 mRNA 水平显著降低。
BMSCs-Exo 处理 SCI 大鼠72ｈ后，利用免疫组化的方法测定 SCI 补体系统中关键蛋白 C1q 的表达（图2B），发现 Sham 组脊髓组织中 C1q 阳性细胞很少，而 SCI 组 C1q 阳性细胞较多，BMSCs-Exo 处理后显著降低了 SCI+Exo 组C1q 的表达。
图2 BMSCs-Exo 减弱 SCI 诱导的补体增加
３、免疫荧光染色及 Western Blot 验证免疫荧光结果显示，Iba-1 在所有 SCI 大鼠损伤部位附近均有大量表达（图３）。在小胶质细胞中发现大量标记的 BMSCs-Exo，其中大部分以小团簇的形式在胞质中聚集。
图3 BMSCs-Exo 选择性靶向受损脊髓中的小胶质细胞/巨噬细胞
Western Blot 分析表明，SCI 会显著增加磷酸化 NF-κB（p-p65）和磷酸化 IκBα（p-IκBα）水平（图4），而 BMSCs-Exo 处理则会显著降低 p-p65和p-IκBα 水平。
图4 BMSCs-Exo 抑制 SCI 诱导的 NF-κB 活化
本研究利用蛋白质组学方法评价了三组间补体系统的变化，并用 RT-PCR 验证蛋白质组学数据，免疫荧光法检测大鼠脊髓损伤后 BMSCs-Exo 的分布，Western Blot 检测 SCI 激活的 NF-κB 水平。最终表明BMSCs-Exo 可作为急性脊髓损伤的潜在治疗手段，补体系统可能是改善脊髓损伤后恢复的重要新靶点。
小 编 总 结
两篇研究论文均通过 TMT 蛋白质组学首先找到组间差异表达蛋白，随后运用 RT-PCR 在基因层面验证蛋白质组学数据，结合免疫荧光、Western Blot 等方法增强文章说服力。本文选题新颖，研究思路清晰，逻辑严谨，投入产出比高，值得广大研究者借鉴。 |
