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转移是肺癌死亡的主要原因。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是肿瘤微环境的一个组成部分，参与肿瘤的发展，肿瘤内缺氧影响癌细胞和基质细胞。外泌体被认为是细胞间通讯的媒介。为了进一步阐明BMSCs来源的外泌体与低氧微环境癌细胞之间的通讯，湖南省肿瘤医院-中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院唐敬群/向娟娟教授团队，利用miRNA基因芯片进行miRNA表达谱分析；采用肺癌细胞和小鼠肿瘤模型，评价外泌体miRNAs的作用；评估低氧BMSCs来源的血浆外泌体miRNAs对癌症患者和非癌症对照组以及有无转移的癌症患者的鉴别能力；证明来自低氧BMSCs的外泌体被邻近的癌细胞摄取，促进癌细胞的侵袭和EMT。该研究不仅发现了新的癌症进展的无创生物标记物，并对BMSCs来源的外泌体miRNAs介导的低氧肿瘤微环境中的细胞-细胞通讯的详细机理进行了阐述。相关成果近期发表在国际期刊《Molecular Cancer》（PMID: 30866952）上。 华盈视角解读： 长期以来，低氧是肿瘤微环境的主要特征，肿瘤微环境中的BMSCs有助于肿瘤的进展。 作者首先在小鼠Lewis肺癌模型（LLC）中测定了BMSCs对肿瘤细胞转移的影响。将稳定转染萤火虫荧光素酶基因（luci-LLC）的LLC细胞单独或与BMSCs一起皮下注射到C57BL/6小鼠体内。与单独注射相比，共注射LLC细胞和BMSCs混合物的小鼠肿瘤更大、荧光素酶活性更强、转移瘤结节数更多，表明在小鼠体内联合注射BMSCs可导致原发性肿瘤的生长和肺转移。接下来，作者利用miRNA基因芯片检测了各组小鼠血浆外泌体miRNAs表达谱，分析显示与单独注射相比，共注射组有86个外泌体miRNAs显著增加，354个外泌体miRNAs显著减少。 然后作者又研究了低氧对BMSCs外泌体释放的影响程度。外形上来看，低氧BMSCs分泌的外泌体比常氧BMSCs分泌的外泌体小，平均直径分别为50 nm和90 nm。同样利用miRNA基因芯片检测了两种培养条件下BMSCs来源的外泌体miRNAs表达谱，并经qPCR再次验证。作者从中选择了体内外表达模式相似的三种外泌体介导的miRNAs（exo-miR-193a-3p、exo-miR-210-3p和exo-miR-5100）进行深入研究。（图1） 图1 低氧BMSCs分泌的外泌体miRNAs提高肺癌细胞的侵袭能力 2.体内外实验验证：外泌体介导miRNAs从低氧BMSCs中转移促进癌细胞的侵袭 为了研究低氧BMSCs来源的外泌体在肺癌细胞侵袭中的作用，作者用外泌体分别处理4款肺癌细胞，确定低氧BMSCs分泌的外泌体促进肺癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）。进一步在C57BL/6小鼠体内证明低氧BMSCs来源的外泌体极大地提高了癌细胞的侵袭，促进癌细胞向肺转移。（图2） 图2 低氧BMSCs分泌的外泌体通过EMT促进肺癌细胞的转移 利用第一部分挑选的3种miRNAs的模拟剂转染癌细胞，发现癌细胞的侵袭进一步增强。而将它们的抑制剂转染到癌细胞后，再加入低氧BMSCs来源的外泌体进行处理，则可以逆转上述外泌体对肺癌细胞侵袭的影响，并抑制间充质相关分子的表达。（图3） 图3 外泌体介导的miRNAs从低氧BMSCs中转移促进肿瘤细胞的侵袭 示踪实验：外泌体经PKH67标记，可以看到荧光标记的外泌体进入LLC细胞。低氧BMSCs来源的外泌体及培养基，均能导致癌细胞内外泌体介导的3种miRNAs表达增加。并且这3种miRNAs在低氧BMSCs中的表达比常氧BMSCs低，表明这些miRNAs大多聚集在胞外小体上，并在细胞外分泌。当用GW4869处理BMSCs时，BMSCs外泌体中的miRNAs显著减少。进一步在C57BL/6小鼠体内进行实验，同样表明这些miRNAs从BMSCs转移到癌细胞。(图4) 图4 外泌体miRNAs从BMSCs转移到癌细胞 3. 调控机制研究：BMSCs外泌体miRNAs通过STAT3驱动的EMT促进转移 为了揭示驱动BMSCs促癌作用对癌细胞的机制，作者利用RNA测序分析了从原发癌部位分离的LLC细胞的基因表达谱，发现上调的基因在JAK-STAT途径中富集，低氧BMSCs来源的外泌体增加了癌细胞的总磷酸化和磷酸化STAT3的表达。STAT3抑制剂能够抑制癌细胞侵袭，低氧BMSCs分泌的外泌体诱导间充质标志物的表达。miRNAs抑制剂可逆转低氧释放的外泌体诱导的磷酸化STAT3的表达，表明外泌体激活STAT3是由外泌体携带的miRNAs诱导的。（图5） 图5 BMSCs外泌体miRNAs通过STAT3驱动的EMT促进转移 4. 标志物验证：外泌体miRNAs可作为肺癌转移的生物标志物 最后，作者通过qPCR进一步评估了72例胰腺癌、肺癌或肝癌患者和30例健康对照者的外泌体miR-193-3p、miR-210-3p和miR-5100的表达水平。这些样本的临床特征如下表。 与健康对照组相比，癌症患者的外泌体3种miRNAs显著上调。转移性肺癌患者血浆3种miRNAs均显著高于非转移性肺癌患者。ROC曲线分析，证明了每个个体的外泌体miRNAs都有能力将癌症患者与非癌对照或转移性肺癌患者与非转移性肺癌患者区分开来，并且在区分转移性肺癌患者和非转移性肺癌患者方面显示出更高的特异性和敏感性。在鉴别转移性肺癌患者和非转移性肺癌患者时，联合3个外泌体miRNAs显示出更高的特异性和敏感性。（图6） 图6 外泌体miRNAs可作为肿瘤转移的生物标志物 小结 综上所述，在本研究中，作者通过miRNA基因芯片发现了低氧BMSCs来源的外泌体miRNAs表达谱，并通过体内外实验阐明外泌体介导的miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100等特异性miRNAs的转移，可以通过激活STAT3信号通路诱导EMT来促进癌细胞的侵袭。这些外泌体miRNAs可能成为预测癌症进展的非侵入性生物标志物。 纵观全文，作者的思路非常清晰，从肿瘤微环境的特点入手，发现表型（BMSCs促进肺癌细胞侵袭转移），广筛基因（miRNAs基因芯片），进一步通过细胞和动物实验从体外和体内两个维度进行验证，分析发现外泌体介导miRNAs从低氧BMSCs中转移促进癌细胞的侵袭，更难得的是进一步进行功能及机制研究，利用RNA测序分析基因表达谱，确定信号通路，阐明了BMSCs外泌体miRNAs通过激活STAT3驱动的EMT促进肺癌转移，最后作者回到临床样本上进行验证，证明了外泌体miRNAs可作为肺癌转移的生物标志物。该研究思路清晰，实验设计严谨，技术路线如图7。 图7 全文技术路线图 华盈生物致力于为广大研究人员和企业提供高品质的外泌体研究解决方案。华盈生物不仅自主研发了新型的EIQ3外泌体提取试剂盒，还提供包括外泌体超速离心、外泌体NTA分析、外泌体透射电镜拍摄、外泌体标志物蛋白Western Blot鉴定、外泌体蛋白质谱分析、外泌体分泌蛋白筛选、外泌体microRNA筛选、外泌体microRNA数字PCR检测等一系列服务环节的“一站式”外泌体服务体系，将为广大用户提供外泌体研究多方位的便利与支持。
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