一种升高高密度脂蛋白、防治动脉粥样硬化的药物及其制备方法（专利）

专利名称：一种升高高密度脂蛋白、防治动脉粥样硬化的药物及其制备方法。 技术领域： 本发明涉及一种升高高密度脂蛋白(HDL)、防治动脉粥样硬化的药物及其制备方法。  背景技术： 脂蛋白代谢的异常与动脉粥样硬化发生、发展关系密切。已有大量临床证据显示，长期 良好的控制血脂，降低血中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)， 升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，可以减轻并抑制动脉粥样斑块，增加粥样斑块的稳定性， 减少大血管事件的发生。目前，临床用于升高HDL、降低LDL抗动脉粥样硬化的药物主要 有 .他汀类，不良反应轻微，严重的不良反应少见，包括横纹肌溶解症(表现肌痛、无力、 肌酸磷酸酶升高等症状)、肝炎以及血管神经性水肿等。与苯氧酸类、烟酸、红霉素、环孢霉 素合用可增加横纹肌溶解症的发生率使其加重。2001年8月8日拜耳制药公司发出紧急指示 立即停止销售且召回西立伐他汀钠。因美国有31例，其他国家有21例服用此药而死亡，其 中12例同时服用吉非贝齐。此外，全世界报道因服用此药发生致死性横纹肌溶解症者有480 例。同年中国SFDA发出通知，暂停销售和使用西立伐他汀钠。西立伐他汀钠事件引起医药 界对调血脂药物与肌病、横纹肌溶解症关系的高度重视。 烟酸类虽可升高HDL，但不良反应多，如面部潮红、心悸和恶心呕吐、腹泻等。大剂量 可引起血糖和血尿酸浓度增高、肝功能异常和变态反应等。 贝特类可致横纹肌溶解症， 一旦发生可能非常严重，引起肌红蛋白尿症和肾衰，尤见 于已有肾损伤的病人。此外，苯氧酸类可致腹痛、腹泻、恶心等胃肠道反应。少数患者出现 变态反应。可见轻度一过性肝脏转氨酶升高。由于氯贝特有导致胆结石的作用，故使用应限 定在已实施了胆囊切除术的患者。 胆汁酸结合树脂不良反应较多，常见胃肠道不适、便秘；血浆TG水平增加；长期应 用，干扰脂溶性维生素及如干扰氯噻嗪、地高辛和华法林等药物的吸收。大剂量发生脂肪痢等；考来烯胺因以氯化物形式应用，长期应用可引起高氯性酸血症。上述药物要么疗效欠 佳、要么不良反应难以耐受。  发明内容 本发明的目的是提供一种具有升高HDL、调节血脂、预防动脉粥样硬化作用的中药有效 部位——南蛇藤茎含有的萜类(COTTs)成分，与现有药物比较具有高效、低毒、价廉、患 者耐受性好的优势，这是利用南蛇藤茎(首创性的拓宽药用部位)提取得到的砲类成分。 一种升高高密度脂蛋白、防治动脉粥样硬化的药物，其特征在于，它是南蛇藤茎的砲类 提取物。 所说的南蛇藤茎的提取物通过以下方法提取将南蛇藤茎用乙醇提取得浸膏，浸膏加水 分散后再经石油醚萃取、乙酸乙酯萃取，然后收集乙酸乙酯层，用水洗涤后，减压浓縮，干 燥，得南蛇藤茎萜类成分。 本专利将卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤CWaWmy oAz'cw/art^ Thunb. (COT)的干燥藤茎分 离提取获得的主要有效成分萜类(Terpenes)应用于正常大鼠，发现应用南蛇藤茎砲类(COTTs) 成分的大鼠血清胆固醇降低、HDL显著升高，可预防动脉粥样硬化，这是首次发现南蛇藤茎 所含有的萜类具有的此作用，迄今为止，尚未见类似报道。在此基础上我们针对南蛇藤所含 有的丰富的萜类化合物进行成分分析及其制备的工艺进行了研究。 具体实施例方式 实施例一南蛇藤茎萜类成分的提取 取南蛇藤茎饮片，加6倍量95%乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇，浸膏加水分散 后用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，用水洗涤3次后，减压浓 縮，干燥，得南蛇藤茎萜类成分。 对南蛇藤茎提取物的乙酸乙酯部位进行相关的化学研究已分离鉴定雷公藤内酯甲，雷 公藤内酯乙，常春藤皂苷元、3p-乙酰齐墩果酸、山海棠二砲内酯A、 (-)-16a-hydroxykauran-19-oicacid、异槲皮苷、槲皮素-7-O-卩-D-葡萄糖苷、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、泽兰黄素、2,4,6-三甲氧基苯酚-l-0-(3-D-葡萄糖苷、卫矛醇等。 上述发明中所述的提取溶剂为50% 100% (W/W)乙醇，上述发明中的干燥方法为喷 雾干燥。 萜类的含量在50%以上。 实施例二升高HDL、防治动脉粥样硬化的应用 l.COTTs对脂质代谢的影响及抗氧化作用。 (1) 小鼠高脂血症模型及COTTs干预作用 建立高血脂模型组喂食高脂饲料(配方胆固醇0.3%+蛋黄粉10%+猪油10%+基础饲 料79.2%+0.5%胆酸盐)，自由进食，进水，每天一次给予灌服0.2mg/10g的蒸馏水，在造模 同时连续给予四周蒸馏水。 (2) 高血脂模型组+辛伐他汀，灌服4.0mg/Kg的辛伐他汀溶液四周。 (3) 高脂模型组+南蛇藤萜(实施例一制得):灌服200， 120，60mg/kg四周。 末次给药后禁食12h，①采血，全血自动生化分析仪检测血清各项指标。②处死小鼠，小鼠 取出肝脏，福尔马林固定，乙醇梯度洗脱，石蜡包埋，然后用旋转切片机(Lieca 2135, Germany) 切成5 ii m薄片，采用hematoxylin and eosin (H&E)染色。 结果如表1 表1.南蛇藤总萜对高脂血症小鼠血清脂质的影响(x-±S,n=10) 组别 正常组 模型组 阳性组 南高组 南中组 南低组 TC (咖o1/1) TG(mmo1/1) LDL (咖o1/1) HDL(mmo1/1) 3. 41±0. 85 4. 97 ±0. 57* 3. 67±0. 38A 4. 05±0.56 4. 20±0. 50 4. 47 ±0. 56* 0. 99±0. 25 1. 11±0. 31 1. 08±0. 13 0.96±0.24 0. 87±0.21 1.08±0.21 0. 18±0. 09 0. 25±0. 03* 0. 18±0. 09A 0.19±0.08 0. 23±0. 06 0. 21±0. 06 3. 03 ±0. 62AA 1.65±0. 58* 1. 79±0. 44' 3.61±0.60A' 3. 84±0.61A' 1. 75±0. 38 注与正常组比较，*p<0.05;与模型组比较，AP<0.05， AAP<0.01a. 建立高脂血症模型,连续经口给予COTTs四周，可显著升高HDL、降低血总胆固醇、甘 油三酯和血清脂蛋白，效果优于辛伐他汀； b. 建立高脂血症模型,连续经口给予COTTs四周，COTTs组血清脂质过氧化物产物丙二醛、 氧化型低密度脂蛋白显著降低,超氧化物歧化酶活力增强，抗氧化效果优于抗氧化剂普罗 不考。 2.COTTs防治动脉粥样硬化 (1) COTTs对动脉粥样硬化家兔模型的干预效果 建立高脂模型健康家兔喂词高脂饲料(1%胆固醇+8%猪油+7%蛋黄粉+84%基础饲料)， 除对照组外，各组于耳中动脉一次性注射牛血清白蛋白(250mg/kg)，对血管内皮产生免疫损 伤，5周后形成类似人AS的病变。 自由进食，进水，模型组造模同时灌以蒸馏水。 (2) 阳性对照组模型组+辛伐他汀，灌服4.0mg/Kg的辛伐他汀溶液5周。 (3) 治疗组模型组+南蛇藤萜(实施例一制得)灌服120， 60，30mg/kg 5周。 末次给药后禁食12h， a.取兔主动脉，进行血管平滑肌细胞(VSMC)培养，经10、 20、 40、 80、 160ug/ml 系列浓度的COTTs干预，对体外培养VSMC增殖的影响取对数生长的VSMC,接种于96孔板， 每孔200ul， C02培养箱培养，待细胞的贴壁融合率达60%左右时，吸弃培养基，分别加入 含不同浓度COTTs的培养基200iU，每组设3孔，另设正常细胞对照组和空白对照组，实验终 止前4h加入MTT液，每孔20iU，继续培养4h，置微量振荡器上低速振荡IO min， 570 nm波 长处测定A值，计算生长抑制率(％) =(1-用药组平均吸光度/对照组平均吸光度)X100%。 以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制量效关系曲线，计算IQo。 COTTs体外对VSMC增殖的影响在80 160u g L i浓度下对VSMC细胞的增殖具有抑 制作用，并呈明显的剂量依赖效应关系，IQo为154ug'L — 1b.家兔主动脉血管内皮平滑肌细胞培养，用同上浓度的COTTs作用于传代培养的细胞， 发现COTTs对血管内皮平滑肌的增殖有抑制作用，表明COTTs对动脉粥样斑块内新生血管 具抑制作用、并可稳定脆性粥样斑块。 取兔主动脉甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。 新生血管免疫组织化学检测对偶数张切片进行免疫组织化学染色石蜡切片用SP法 染色，新生血管染色呈棕黄色/棕褐色，内皮细胞标志物CD31染色为阳性结果。计数方法为 每张切片选择3个血管最多的区域，400倍光镜下计数，取平均每个视野的新生血管数定为新 生血管密度。新生血管的判断标准凡是染成棕黄色，数个内皮细胞或内皮细胞簇作为l个新 生血管(管腔较大、有较厚肌层的血管均不计数)。应用COTTs抑制新生血管形成的作用高 剂量组8.7士1.6 (支)，与模型组比较(14.3±3.4)差异极显著；中、低剂量组亦有显著性差 异。 主动脉形态学检查第5周处死动物，自主动脉瓣至髂动脉分叉处取出主动脉，在背侧 面纵行切开，从主动脉弓取约lcm标本，用40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定，低温石蜡包埋、切片， 然后HE染色。 肉眼观察主动脉斑块情况主动脉剖开后,对照组主动脉内膜表面光滑，未见动脉粥样 斑块，AS模型组病变严重，粥样斑块面积大，分级为2 3级，广泛累及各段内膜，粥样斑块 厚。主动脉组织切片显微镜可见对照组主动脉内膜完整，AS模型组内膜显著增厚，内皮多 处破损，并有数层泡沫细胞，内膜下SMC由斑块深部向浅层增生明显，位于病灶深部SMC大多 呈长梭形，浅层者多为梭形或类圆形，细胞外基质明显增多；C0TTs处理后，低剂量组内皮破 损轻微，有散在的少量泡沫细胞出现，细胞外基质增加不明显，尤为高剂量下，主动脉内膜 较光滑，内膜下未见SMC增生。 权利要求 1、一种升高高密度脂蛋白、防治动脉粥样硬化的药物，其特征在于，它是南蛇藤茎的萜类提取物。 2、 制备权利要求1所说的药物的方法，其特征在于，将南蛇藤茎用乙醇提取得浸膏，浸膏加 水分散后再经石油醚萃取、乙酸乙酯萃取，然后收集乙酸乙酯层，用水洗涤后，减压浓縮， 干燥，得南蛇藤茎萜类成分。 3、 如权利要求1所说的制备方法，其特征在于，取南蛇藤茎饮片，加6倍量95%乙醇提取2 次，合并提取液，回收乙醇，浸膏加水分散后用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次， 收集乙酸乙酯层，用水洗涤3次后，减压浓縮，干燥，得南蛇藤茎砲类成分。 全文摘要 本发明公开了一种升高高密度脂蛋白(HDL)、防治动脉粥样硬化的药物及其制备方法。它是从南蛇藤属植物南蛇藤茎中提取分离得到的萜类部位。经药理学实验证明，该提取物对正常及高脂模型动物具有良好的预防和治疗作用，它的有效成分较明确，有利于保证调节血脂、预防AS的有效性和长期使用的安全性。 文档编号A61K36/185GK101439075SQ20081024255 公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日 发明者慧 刘, 云 孙, 强 王, 夏 邱 申请人:扬州大学。