今天为大家介绍一篇单细胞分析乳腺癌中癌症干细胞的文章[Identification of Distinct Breast Cancer Stem Cell Populations Based on Single-Cell Analyses of Functionally Enriched Stem and Progenitor Pools (Stem Cell Reports; 2016;IF:6+)],这篇文章对乳腺癌干性细胞进行了详细分析与刻画，特别是对单细胞感兴趣的小伙伴可以好好研究下。
由于疾病的复杂性和一般标记物的缺乏，鉴定具有真正恶性干细胞特性的乳腺癌细胞亚群成为了一项挑战。作者使用三种功能富集策略，识别出了乳腺癌中不同的干性细胞簇，其中雌激素受体（ER）a +肿瘤具有清晰的组织分层，不同簇之间具有开关样和逐渐过渡，说明乳腺癌细胞以连续方式在离散的分化状态之间转移。 ERa-乳腺癌显示不太明显的聚集，但与ERa +癌症共享一个静息癌症干细胞池。 细胞组织模型由来自原发性肿瘤的单细胞数据支持。 这些发现有利于我们了解单细胞水平的乳腺癌组织，从而可以更好地识别和靶向癌症干细胞。说到这里我们首先介绍下这三种干细胞的富集的方法：
如上图所示，第一种干细胞富集方法是抗失巢凋亡的细胞AR，即不依赖贴壁生长的细胞；第二种是在缺氧条件下培养的细胞；第三种是亲脂性PKH26染料标签维持的细胞。
而单细胞表达数据的获取过程如下：
获取了单细胞的表达数据后作者进一步通过文献搜集到了不同功能状态的marker基因，与分化相关的关键markers（CDH1，CD24，EPCAM，ESR1，PGR），乳腺癌干性相关的markers（CD44，ITGA6，DNER，ALDH1A3，ABCG2），多能性相关的markers（POU5F1，NANOG，SOX2），EMT /转移markers（SNAI1，SNAI2，FOSL1，VIM，CDH2，ID1）和增殖相关的markers（CCNA2，MKI67，ERBB2）具体如下：
主要的方法概念介绍好了，接下来我们看下作者得到哪些主要的结果吧：
结果1：在ERa+细胞系中定义具有CSC和不同分化表型的亚群
图A作者对MCF7细胞系中抗失巢凋亡的细胞与贴壁生长的单层细胞的表达情况做了PCA分析，然后作者又在图B进一步分析了基因在PCA中的载荷,从图A中可以看出细胞系被分成了三类分别是ERa+ I,ERa+ II,ERa+ III,图C中可以看出不同功能状态的marker在三类细胞中的表达情况。根据三类细胞marker基因的表达高低可以看出ERa + I细胞显示多能性相关基因NANOG和POU5F1的高表达，分化和增殖相关基因低表达，以及总转录水平较低，表明这些细胞可能处于静止状态，ERa + II细胞表现出乳腺CSC相关基因（CD44，ALDH1A3和ABCG2）和增殖相关基因（CCNA2，MKI67和ERBB2）的高表达，通过分化相关基因和增殖标志物的高表达来刻画ERa+ III细胞。接着作者又对ML和AR两类细胞进行了差异表达。
为了对结果进一步验证，作者同样对T47D细胞系的不同细胞的表达情况进行了同样的分析，可以看出经过PCA细胞被分成了两类，并分析不同marker的表达。为了鉴定所应用的CSC富集方法中涉及的基因和过程，比较了ML和AR细胞之间差异表达的基因。 在AR细胞中，CDH1，CD24，EPCAM，ESR1，PGR和ID1被下调并且FOSL1在两种细胞类型中上调，而CCNA2仅在MCF7细胞中下调（图2D和2H）。 MCF7和T47D细胞的这种共同调节表明类似的富集机制。
结果2：定义ERa-乳腺癌细胞系的增殖表型
作者对两类ERa-细胞系即CAL120与MDA231这两类细胞系的ML与AR细胞打的表达数据进行了与结果1同样的操作，PCA分析以及marker表达的分析，分析细胞倾向于哪种功能状态。将CAL120细胞分成了ERa-I，ERa-III。同样地，159个单独的MDA231细胞（ML：n = 84; AR：n = 75）的PCA显示存在两个细胞簇ERα-II和III。 ALAH1A3，ABCG2和SNAI1在ERα-II细胞中略微但不显着地上调。 ERa -III细胞表现出FOSL1，VIM，CCNA2和MKI67的升高的表达。 AR细胞富集在簇ERα-II中，而ML细胞富集在簇ERα-III中。
结果3：在ERα+和ERα-细胞中识别共同的CSC亚群
为了检测乳腺癌细胞中的共同亚群，将所有单细胞数据标准化，合并，并进行组合分析，上图示意性地说明了所识别的子群体之间的分层组织。 在ERα+细胞系中鉴定出两种不同的分化模式。 MCF7细胞在它们获得完全分化的表型（ERα+ III）之前通过祖细胞样状态ERα+ II分化，而T47D细胞在不通过这种祖细胞状态的情况下分化。 另一方面，ERα-细胞系似乎通过增加与ERα+细胞共享的常见静止CSC样池的增殖能力来区分。
为了验证我们在临床背景下的发现，我们接下来分析了两个原发性乳腺癌样本中的单个细胞，而其他细胞表达与分化的细胞状态相关的标志物。具有共同的未分化基因表达谱的细胞数量相当高，可能包括常见的祖细胞和CSC。图G总结了原发性肿瘤细胞中的分化途径，其与基于CSC部分的操作描绘的细胞系划分的细胞层次一致。
结果4：缺氧条件下在ERα+ MCF7细胞中富集具有CSC特征的两个不同群体
结果4的分析方法基本与之前相同，在缺氧条件下，对ERa+细胞系的表达情况进行分析，用CA9来判断缺氧情况，由于PCA分类的结果不理想，所以采用自组织映射的方法将细胞分成四类，这四类细胞的表达情况如图D所示，并对缺氧和正常细胞的表达进行了差异表达分析。
结果5：刻画了标记保留的MCF7细胞中三个CSC样表型的亚群
在结果5中，作者分析了染色标签保留的细胞的表达谱，用自组织映射分析，将细胞划分成三类，这三类细胞不同功能状态marker的表达热图如上图所示，可以看出三类细胞的表达有差异，具有不同的表达表型。
结果6：ERa + MCF7细胞包含不同的细胞状态，并有不同的组织分层
来自三种CSC富集技术（包括相应的单层群体）的所有MCF7单细胞数据组合，PCA和SOM允许我们关联和分层组织鉴定表型状态。 可以使用SOM将单个细胞分成四个稳定簇（MCF7 I-IV）。来自三种富集技术的细胞存在于所有定义的簇中比例不同，MCF I对应于ERα+ I，MCF II-III对应于ERα+ II，MCF III对应于ERα+ III。 基于所鉴定的簇之间观察到的逐渐基因调节，提出了MCF7细胞的分层组织(图D).在这种情况下，具有静止CSC特征的MCF7 I组代表层次结构的顶点，并且在不同的细胞状态上发生分化，发生在MCF7 IV组中最分化的细胞。 首先，上皮基因在与EMT相关的基因同时被激活，并且乳腺CSC变得失活。 然后，在第二步中，与多能性相关基因下调同时上调与增殖相关的基因。
到这里，主要的结果和方法就介绍完了，是不是也有很多收获呢，这篇文章通过单细胞对乳腺癌中的干性细胞进行详细的刻画，尤其单细胞层面可以更好的刻画肿瘤异质性，值得我们学习。
