PCL-MECM水凝胶装载半月板纤维软骨细胞促进半月板再生

小梦想在努力 2020-02-27

展开全文

中国人民解放军总医院骨科研究所郭全义教授团队和北京积水潭医院周一新教授团队结合上述三者的优势，将半月板纤维软骨细胞种植于PCL-MECM为基底的水凝胶混合支架上，研究其对半月板再生的影响（图1）。

Figure 1. Schematicdiagram of the overall study design.

首先，研究者对不同浓度的MECM的水凝胶特性进行了研究。研究发现随着MECM浓度的增加，水凝胶的孔径和孔隙率减小（图2）。

Figure 2. (A) Macroscopic features, (B) SEM images, (C) pore size and (D) porosity of five concentrations of MECM-basedhydrogels.

随后研究者对细胞生存能力、细胞增殖和基质形成情况进行了分析。结果显示在各个浓度组中，细胞的存活率均较高。2%MECM组水凝胶比其他组有更强的促进细胞增殖的作用。2%MECM组软骨细胞标志物表达水平明显高于其他组。这些结果表明，2%的MECM组水凝胶有很大的潜力作为组织工程的理想生物材料（图3）。

Figure 3. (A) Live/dead cell staining and (B) viability analysis of MFCs cultured in MECM-based hydrogels for 7 days; representative images showed dead (red) cells, live (green) cells and 3D reconstruction images of the MCFs distribution in the MECM-based hydrogels. (C) CCK-8 assay of MFCs encapsulated in MECM-based hydrogels after 1, 4, 7 and 14 days of culture. (D) DNA content, (F) total GAG and collagen of the cell/hydrogel constructs at different time points. (E) The expression of collagen I, collagen II, SOX 9 and aggrecan of MCFs cultured in MECM-based hydrogels compared to MFCs at P3 in monolayer culture.

紧接着研究者对混合支架的特性进行了研究，发现混合支架能较好地模拟活体组织结构，具有较好的力学性能，并且复合支架材料具有良好的生物相容性和较低的免疫原性（图4）。

Figure 4. A 3D reconstruction model (A2) of the rabbit meniscus (A1) wasgenerated to calculate its size. We then designed a 3D wedge-shaped model withcircumferentially and radially oriented fibers (A4), which simulated thenatural collagen fiber arrangement within the native meniscus (A3). Finally, weinjected the optimized MECM-based hydrogel into the 3D-printed porous PCLscaffold (A5) to construct a PCL-MECM based hydrogel hybrid scaffold (A6). (B)The compression and tensile moduli of the hybrid scaffold and the nativemeniscus. (C) H&E images of the hybrid scaffold’s immune response in vivoat 1 week and 1 month.

随后，对半月板的组织形态进行分析。我们发现支架组(PCL组、PCL-hydrogel组、PCL-hydrogel-MFCs组)均在种植后3、6个月再生新半月板。PCL-hydrogel-MFCs组新生半月板的形状与大小均优于其他两组。所有支架组6个月时再生半月板的形态明显好于3个月，半月板覆盖率在6个月时明显高于3个月（图5）。

Figure 5. (A) Scaffold implantation and experiment grouping schema. The blue arrow indicatesa well preserved medial collateral ligament. (B) Macroscopic observations of knee joints at 3 and 6 months after implantation. Excised menisci are shown onthe right. (C) Meniscus covering rates at 3-and 6-months post-operation.

然后研究者对新生半月板进行组织学评估及力学分析。与第3个月相比较，6个月时三个支架组内侧软骨样细胞较多，而成纤维细胞样细胞较少。6个月时Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和糖胺聚糖的表达量较3个月时均升高。PCL-hydrogel-MFCs组移植后6个月后再生半月板的组织学特征与阴性对照组相似。再生半月板的拉伸模量和压缩模量在PCL-hydrogel-MFCs组均显著高于PCL-hydrogel组和PCL组，同一实验组中，6个月再生半月板的抗拉和抗压模量普遍高于3个月再生半月板。PCL-hydrogel-MFCs组与阴性对照组的拉伸模量相似（图6）。

Figure 6. (A) Histological staining and immunohistochemical analyses of the regenerated menisci. (B) H&E staining images of the femoralcondyle and tibial plateau cartilage. (C) Ishida histological score for the regenerated menisci. (D) The total collagen and GAG contents, (E)the tensileand compressive moduli of the regenerated menisci.

最后对膝关节进行了影像学的评估。X线片显示，与其余两组支架组相比，PCL-hydrogel-MFCs组的膝关节状态最佳，未见到明显关节间隙变窄及骨赘形成。MRI检查显示PCL-hydrogel-MFCs组在移植后3个月观察到再生的半月板，并随时间生长。软骨表面光滑，无明显炎症信号，而其余两个支架组的半月板较小，并且光滑程度不如PCL-hydrogel-MFCs组（图7）。