数字光处理3D打印丝素蛋白水凝胶用于气管组织工程

由于肿瘤、创伤和先天性疾病引起的气管狭窄或气管软化严重影响患者生活质量。通过球囊扩张及支架植入虽可暂时缓解症状，但易出现二次狭窄及其他并发症。手术切除是治疗气管恶性肿瘤及气管狭窄的最有效方式。但较长病灶手术切除后吻合口张力过大，常难以愈合。因此，选择合适的气管替代材料，缓解吻合口张力，对于治疗气管长段缺损极为关键。组织工程是实现组织再生修复的最有效方式。近几年来，3D打印技术迅速发展，仅依据三维数据就可以快速制造出所需组织器官结构，堪称组织再生领域“工业革命”。数字光处理（Digital Light Processing, DLP）3D打印技术使用较高分辨率的数字光处理器来固化液态聚合物，通过对液态聚合物层层固化，可快速高效地实现仿生组织构建，因此收到广泛青睐。近期，来自韩国翰林大学医学院Chan Hum Park教授团队基于DLP 3D打印技术，以丝素蛋白-甲基丙烯酸缩水甘油酯（Silk-GMA）为材料，成功构建出具备一定力学特性的人工气管，并首次进行体内移植实验，取得理想的效果。

研究者用含有光引发剂的无血清培养基溶解冻干后的Silk-GMA海绵，再分别混合软骨细胞或NIH3T3细胞制成生物墨水，通过DLP 3D打印机完成气管软骨组织打印。经无菌PBS洗涤后，置于含血清的培养液中体外培养（Fig. 1）。

Fig. 1 Diagram of DLP 3D bioprinting procedure using Silk-GMA with chondrocytes.

通过PKH染色（细胞膜染色）及Masson三色染色分析发现Silk-GMA水凝胶体系中，上层及下层细胞数目无显著差异（Fig. 2）。

 

Fig. 2 Analysis of cell distribution and changing cell dose depend on cultivation period in the Silk-GMA hydrogel after DLP 3D printing was performed with NIH 3T3, mouse fibroblast cell line.

细胞增殖实验结果提示细胞在Silk-GMA水凝胶体系中培养14天均能稳定增殖，且随着时间延长增殖速率逐渐增加（Fig. 3A）。活/死染色结果表明，随着培养时间的延长，细胞活性也逐渐增加（Fig. 3B）。 

Fig. 3. In vitro cell proliferation and viability assay for human chondrocyte in Silk-GMA hydrogel.

加载软骨细胞的Silk-GMA水凝胶体外培养1周、2周、3周及4周后，研究者分别对其进行H&E染色、Masson三色染色、番红染色及PKH染色。H&E 及Masson三色染色结果提示随着时间延长，新生软骨细胞数目逐渐增加。番红染色及PKH染色结果提示在水凝胶空隙中有较多软骨细胞生长（Fig. 4）。以上结果表明Silk-GMA水凝胶体系是细胞生长的良好介质，且能长时间维持软骨细胞特性。

 

Fig. 4. In vitro histological detection of human chondrocytes-laden Silk-GMA hydrogel for cartilage tissue formation.

糖胺聚糖（GAG）可保证软骨细胞一定的含水量，进而使软骨组织耐受外界应力负荷。研究者发现软骨细胞在Silk-GMA水凝胶体系中培养4周后，GAG含量增加了三倍（Fig. 5A）。此外，软骨细胞特异性基因II型胶原、X型胶原、SOX-9及蛋白聚糖表达随着时间延长也逐渐增加（Fig. 5B）。以上结果表明Silk-GMA水凝胶体系也可有效促进软骨形成相关基质分泌。

Fig. 5. Analysis of GAG concentration and expression of chondrocytic specific gene for human chondrocyte-laden Silk GMA hydrogel in vitro culture.

研究者进行了初步体内实验，将无软骨细胞及加载有软骨细胞的Silk-GMA水凝胶植入裸鼠皮下，分别在第1、2、4周及第8周取材进行H&E染色、Masson三色染色、番红染色及PKH染色。结果发现加载有软骨细胞的Silk-GMA水凝胶中有较多蛋白多糖及胶原产生。此外H&E染色及番红染色结果提示Silk-GMA水凝胶孔隙中有较多软骨细胞生长及软骨形成相关基质分泌（Fig. 6）。

 

Fig. 6. In vivo histological evaluation of chondrocytes-laden Silk-GMA hydrogel for cartilage tissue engineering in dorsal subcutaneous part of nude mice.

最后，研究者用加载有软骨细胞的Silk-GMA水凝胶修复兔气管缺损（Fig. 7A,B）。术后每两周通过内窥镜进行观察，发现术区有较多周围软组织长入，并逐渐成为气管的一部分（Fig. 7C）。

Fig. 7. Schematic summaries of chondrocytes-laden Silk-GMA hydrogel transplantation and endoscopic observation of rabbit trachea for 6 weeks after transplantation.

综上，该研究中作者利用加载有软骨细胞的Silk-GMA水凝胶成功构建气管软骨组织，通过体外实验证明Silk-GMA水凝胶体系可保持软骨细胞活性、维持软骨细胞特征并能促进软骨形成相关基质分泌。此外，作者首次进行了兔气管修复，并取得理想的效果。

本研究由韩国翰林大学医学院Chan Hum Park教授团队完成，于2019年12月13日在线发表于Biomaterials。

论文信息：

Heesun Hona, Ye Been Seo, Do Yeon Kim, Ji Seung Lee, Young Jin Lee, Hanna Lee, Olatunji Ajiteru, Md Tipu Sultan, Ok Joo Lee, Soon Hee Kim, Chan Hum Park*. Digital light processing 3D printed silk fibroin hydrogel for cartilage tissue engineering. Biomaterials 2020, 232: 119679.

供稿：张维东

审校：过倩萍

编辑：丁路光