王直兵｜兔韧带－骨界面移行结构的组织工程学构建

引用本文: 王直兵, 张瑗, 郝勇, 等.  兔韧带－骨界面移行结构的组织工程学构建 [J]. 中华外科杂志,2016,54( 4 ): 286-291.

作者单位：解放军第三军医大学附属新桥医院骨科

交叉韧带是维持膝关节稳定和功能的重要结构^[1]，但细胞分布和营养血供差的特点决定其损伤后难以自愈，并产生一系列并发症，严重影响膝关节功能。有研究结果发现，在韧带－骨组织间100 μm至1 mm的区域存在一个复杂的、连续的移行带，即表现为异质性的细胞、细胞外基质、矿化程度的梯度分布^[2]，该结构可保证韧带－软骨下骨连接的解剖完整和力学稳定。故我们认为交叉韧带重建的目标应是重建韧带－骨界面间具有异质性移行层次的韧带－骨连接体。鉴于此，我们以取材方便、来源广泛且与交叉韧带力学性能相仿的脱细胞兔跟腱作为支架，并将其分成3个连续的功能区域(各10 mm)。通过胶原水凝胶依次将成纤维细胞、软骨细胞及成骨细胞种植于3个区域内，体外共培养3周后行组织学染色、免疫荧光分析，检验该工程肌腱的体外构建效果。

材料与方法

一、实验动物及主要试剂、仪器

5月龄雄性新西兰大白兔10只，体重4～5 kg，由新桥医院动物实验中心提供。家兔上皮组织成纤维细胞(CRL－2087，美国ATCC公司)，Ⅱ型胶原蛋白酶、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal calf serum，FBS)(美国HyClone公司)；HEPES、十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、TritonX－100(上海生工生物工程股份有限公司)；DMEM培养液、转化生长因子－β1、抗坏血酸、胶原酶(美国Sigma公司)；Cell Counting Kit 8(CCK－8)试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；S－3400N扫描电镜(日本Hitachi公司)；DU－70型紫外分光光度计(美国Beckman公司)；微量注射器(浙江三爱仪器厂)。

二、细胞分离和培养

家兔上皮组织成纤维细胞CRL－2087保存在含有10% FBS、20 U/ml青霉素和20 mg/L链霉素的DMEM培养液中(37 ℃、5% CO₂、pH值7.4)，当细胞融合率为70%～80%时传代培养，取4～8代细胞进行后续实验。

按照参考文献[3,4]的方法，取15日龄的新西兰大白兔，麻醉下脱颈处死，取股骨髁全层软骨，切碎(1 mm³)，2 g/L Ⅱ型胶原酶溶解，PBS漂洗后用软骨细胞培养液(含10% FBS、1%非必需氨基酸、50 mg/L维生素C、46 mg/L脯氨酸、20 mmol/L HEPES、20 U/ml青霉素和20 mg/L链霉素)在振动台内(37 ℃，5% CO₂)培养16 h。培养3 d后，细胞融合率为70%～80%，使用Ⅱ型胶原酶消化传代培养，取4～8代细胞进行后续实验。取颈椎的松质骨，切碎，在37 ℃条件下用0.25%的胰蛋白酶消化15 min后，用成骨细胞培养液中和后在振动台内(37 ℃)放置24 h，当骨碎片浮于培养液表面时，翻转培养瓶并继续培养4 h(37 ℃、5% CO₂)以加速细胞黏附。3 d后，当细胞融合率为70%～80%时，采用胰蛋白酶消化贴壁细胞法纯化后用含10% FBS、20 U/ml青霉素和20 mg/L链霉素的普通培养液培养。

三、胶原水凝胶的制备

参照Rossi等^[5]的方法，制备胶原水凝胶，此水凝胶在－4 ℃时不会凝胶，37 ℃温箱内静置时则会发生凝胶现象。首先溶解100 mg的可溶于酸的牛皮肤Ⅰ型胶原于40 ml 0.1%的无菌乙酸溶液(用无菌双蒸水配制，220 μm细菌滤过器过滤除菌)中(溶液A)，接着分别配制0.34 mmol/L的NaOH和10×DMEM液，220 μm细菌滤过器过滤除菌后，按体积比1∶2的比例将0.34 mmol/L的NaOH和10×DMEM液混匀(溶液B)，最后将溶液A与溶液B按4∶1的体积比混匀(溶液C)，220 μm细菌滤过器过滤除菌后，在超净台内向溶液C内加入1%的青霉素/链霉素即为本实验所需的胶原水凝胶溶液，同时检测其细胞兼容性。

四、脱细胞跟腱支架的制备及细胞兼容性检测

取10只新西兰大白兔双后肢跟腱，长5～6 cm，共20条。机械去除附着组织，PBS清洗后，置于－70 ℃深低温冰箱冷冻10 min，37 ℃恒温水浴箱内处理10 min，反复5次。PBS充分漂洗后，于37 ℃下依次进行如下处理：0.5%胰蛋白酶振荡2 h，PBS漂洗3次，每次30 min；10% TritonX－100振荡12 h，PBS漂洗3次，每次30 min；5% SDS振荡2 h，PBS漂洗3次，每次30 min，即获得脱细胞跟腱。取脱细胞跟腱置于70%乙醇浸泡1 d，无菌PBS漂洗过夜后，沿其横切面剪成直径4 mm、厚2 mm的小片，平铺于96孔板内。将1 ml兔成纤维细胞(密度为1×10⁶/ml)培养液悬液加至96孔板中的脱细胞跟腱表面，对照组采用1 ml胶原水凝胶混悬兔成纤维细胞(密度为1×10⁶/ml)，在37 ℃、5% CO₂条件下培养，于1、3、5、7、9 d各取3孔，按照CCK－8试剂盒操作添加10% CCK－8试剂后继续孵育2 h，于紫外分光光度计450 nm波长下检测吸光度(A)值。以时间为横坐标，A值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

五、细胞与支架的复合

实验分为单纯支架组、成纤维细胞＋软骨细胞组(Fb＋CC组)、成纤维细胞＋成骨细胞组(Fb＋OB组)、成纤维细胞＋软骨细胞＋成骨细胞组(Fb＋CC＋OB组)。将支架(长30 mm)用70%乙醇浸泡1 d后用无菌PBS漂洗过夜。

本研究按以下方法构建'移行结构化'(肌腱－软骨－骨)细胞－肌腱复合物：分别取液态水凝胶1 ml重悬密度为1×10⁶的种子细胞(成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞)，并用1 ml注射器将成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞依次沿支架纵轴注射入成纤维段(FB段)、成软骨段(CH段)和成骨段(OS段)(此过程在10 min内完成)。待水凝胶完全固化后，将复合物置于含10%胎牛血清、1.5 g/L β－磷酸甘油、100 U/ml青霉素、100 g/ml链霉素、10 μg/L转化生长因子－P、50 mg/L抗坏血酸的DMEM/F12高糖培养液中，静置培养3周，即为本实验所构建的韧带替代物；其余各组未注入种子细胞区域采用等量水凝胶处理。

实验中此支架被分成单独的3段，软骨细胞种植于支架的中间(长度约10 mm)，成纤维细胞种植于支架的一端(长度约10 mm)，成骨细胞种植于支架另一端(长度约10 mm)(图1)，模拟韧带－骨界面的结构，构建仿生的'移行结构化'工程肌腱。

图1

'移行结构化'细胞－肌腱复合物的设计原理图

六、免疫荧光和组织学分析

将培养3周的复合组织工程韧带予10%多聚甲醛固定、石蜡包埋、5 μm厚度连续切片后行免疫荧光和组织学染色。以小鼠抗兔Ⅱ型胶原2A1(稀释浓度为1∶50)和山羊抗兔骨钙素(稀释浓度为1∶100)作为一抗标记组织切片，以FITC标记的驴抗小鼠(稀释浓度为1∶50)及cy3标记的驴抗山羊(稀释浓度为1∶100)荧光抗体为二抗，二脒基苯基吲哚溶液行细胞核标记，观察复合物内软骨细胞段及成骨细胞段的软骨、骨的形成情况，同时用HE、阿利辛蓝和茜素红染色分别观察复合组织工程韧带内纤维组织、软骨及骨的连续分布情况。

结果

一、脱细胞跟腱大体及组织形态学观察

跟腱经脱细胞处理后腱膜完整，表面有光泽、质柔软、韧性好。新鲜跟腱内HE染色结果显示细胞核深染成蓝色，排列整齐，成串样分布(图2A)，电镜下观察胶原纤维排列致密，孔隙较少(图2B)；经脱细胞处理后腱束间的疏松结缔组织和腱细胞消失，胶原纤维排列疏松，腱束间可见较多孔隙存在(图2C)，电镜观察可见跟腱内胶原纤维排列疏松，腱束间孔径增加(100～300 μm)，孔隙率几乎达到了50% (图2D)。

图2

脱细胞前后兔跟腱的组织形态学结构：2A为光镜下观察脱细胞处理前的图像，可见跟腱内细胞核深染成蓝色，排列成串(HE染色　×200)；2B为电镜下观察脱细胞处理前图像，可见跟腱内胶原纤维排列致密，孔隙较少(×500)；2C为光镜下观察脱细胞后图像，可见跟腱内未见细胞成分存在，胶原纤维排列疏松，有较多孔隙存在(HE染色　×200)；2D为电镜下观察脱细胞后图像，可见胶原纤维排列疏松，孔径及孔隙率明显增加(×500)

二、脱细胞跟腱及胶原水凝胶细胞兼容性分析结果

培养9 d内实验组和对照组细胞的A值均呈缓慢增加趋势，显示存活细胞在支架表面或胶原水凝胶内呈平稳增加，支架组与胶原水凝胶对照组差异无统计学意义(P>0.05，图3)。

图3

CCK－8法检测兔上皮组织成纤维细胞CRL－2087在脱细胞支架表面培养9 d内的增殖曲线

三、组织学和免疫荧光分析结果

我们采用连续切片及特殊组织学染色观察复合物内基质连续分布。通过茜素红染色观察复合物内的钙结节形成，结果显示钙结节只存在于Fb＋CC＋OB组和Fb＋OB组的OS段内，其余区域内未发现有明显的钙结节形成(图4A，图4B，图4C，图4D)。通过阿利辛蓝染色观察复合物内的糖胺聚糖(glycosamino glycolic acid，GAG)形成，结果显示GAG只存在于Fb＋CC＋OB组和Fb＋CC组的CH段内，其余节段内未发现有明显的GAG形成(图4E，图4F，图4G，图4H)。在纤维生成区内(FB段)，HE染色观察到几乎与脱细胞前跟腱一致的细胞及胶原纤维分布，新生成的相互连接的纤维明显缩小了支架的孔径及孔隙率，而单纯支架组则呈现与细胞接种前完全一致的结构，但由于接种细胞的同源性，在各组间未发现有明显差异(图4I，图4J，图4K，图4L)。

图4

各组复合物内不同区域的纤维、软骨、骨生成图像(×200)：4A～4D依次为茜素红染色评估单纯支架组、成纤维细胞＋软骨细胞组(Fb＋CC组)、成纤维细胞＋成骨细胞组(Fb＋OB组)、成纤维细胞＋软骨细胞＋成骨细胞组(Fb＋CC＋OB组)支架成骨区的成骨生成图像，4E～4H依次为阿利新蓝染色评估Fb＋CC组、Fb＋OB组、Fb＋CC＋OB组支架成软骨区的成软骨生成图像，4I～4L依次为HE染色评估Fb＋CC组、Fb＋OB组、Fb＋CC＋OB组支架成纤维区的纤维形成图像

免疫荧光分析结果也证实了仅在Fb＋CC＋OB组和Fb＋OB组的OS段内有OCN，两组间钙结节及OCN的生成无明显差异(图5A，图5B，图5C，图5D)。免疫荧光分析结果证实，COL2A1只存在于Fb＋CC＋OB组和Fb＋CC组的CH段内，两组间GAG及COL2A1的生成未见明显差异(图5E，图5F，图5G，图5H)。

图5

各组细胞支架内骨、软骨生成的免疫荧光图像(×400)：5A～5D依次为单纯支架组、成纤维细胞＋软骨细胞组(Fb＋CC组)、成纤维细胞＋成骨细胞组(Fb＋OB组)、成纤维细胞＋软骨细胞＋成骨细胞组(Fb＋CC＋OB组)支架内成骨区山羊抗兔骨钙素生成图像，5E～5H依次为Fb＋CC组、Fb＋OB组、Fb＋CC＋OB组支架内成软骨区的COL2A1生成图像

讨论

交叉韧带重建是当前矫形外科和再生医学共同面对的难题。目前临床上多采用同种异体肌腱移植^[6]，但其来源受限且成本高昂，且长期随访结果显示，仍有10%～25%的失败率^[7]，分析其原因为：(1)异体移植物的排斥反应，未经抗原处理的异种肌腱直接用于移植后会引起宿主的排斥反应，导致失败；(2)'雨刷效应'使骨隧道扩大、移植物磨损进而造成松弛乃至断裂^[8,9]。因此，降低移植物的免疫原性、构建拟生理的韧带－骨界面结构(纤维－纤维软骨－软骨下骨)将有效提高交叉韧带重建的远期成功率。

目前降低组织器官抗原性多采用脱细胞法，如反复冻融、胰蛋白酶、Triton X－100、SDS等，但各自均有不足之处。反复冻融可以高效裂解组织和器官内的细胞，并能降低支架材料的免疫原性，但并不能清除膜性和细胞内成分^[10]；胰蛋白酶能有效提高后续脱细胞试剂对组织的穿透力，但会破坏组织的超微结构^[11]；Triton－X－100在组织中有很好的细胞清除作用，但对组织的超微结构破坏和蛋白聚糖的清除作用较弱^[12,13,14]；SDS能高效地清除细胞核残余物、胞质蛋白，但有减少糖胺聚糖、生长因子及毁坏胶原纤维的趋势^[15,16]。综合考虑，我们联合运用这4种方法对兔跟腱行脱细胞处理，并行组织学、电镜扫描及细胞兼容性检测，结果显示脱细胞后腱束间孔径增加(100～300 μm)，孔隙率达50%以上，且细胞兼容性良好，利于异质性细胞的生长，这一结果与既往研究结果相似^[17,18]。

Dormer等^[19]研究发现，理想的韧带－骨移行结构替代物应体现理化性质、生长信号及细胞表型的连续过渡。Bi等^[20]和Spalazzi等^[21]利用聚乳酸－乙醇酸共聚物(polylactic/poly glycolic acid，PLGA)网架(A相)、PLGA微球(B相)和PLGA/生物玻璃(C相)构建同种三相支架，将成纤维细胞和成骨细胞分别植入A、C相共培养后发现Ⅰ型胶原和矿化区域的形成，B相见明显细胞迁移、基质和血管生成，但无明确的纤维软骨。后续将成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞扩增培养，术后2个月可见连续的纤维软骨样组织桥接于A、C相之间，软骨样细胞栖息于Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基质内，成功地在软组织、骨界面间实现软骨缓冲区的再生。尽管如此，该三相支架替代韧带仍存在生物力学特征(如韧性、弹性模量、组织兼容性等)的差异。

因此，本研究采用取材方便、来源广泛、与交叉韧带力学性能相仿的脱细胞兔跟腱为支架，并人为地将支架设为3个功能区(FB区、CH区、OS区)，采用胶原水凝胶技术分别将成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞接种于FB区成纤维、CH区成软骨及OS区成骨，构建细胞、基质及功能渐变的组织工程细胞－肌腱复合物，在体外模拟生理性韧带－骨连接位点结构，从而实现韧带－骨界面的再生。

首先，通过反复冻融、Trypsin、TritonX－100、SDS对兔跟腱进行脱细胞处理，与新鲜跟腱相比，腱束间腱细胞消失，孔径及孔隙率都显著增加；通过细胞兼容性检测，细胞与支架共培养9 d内细胞吸光度值呈缓慢增加趋势，提示该支架细胞兼容性良好，适于异质性细胞的生长。

其次，对共培养3周后的细胞－肌腱复合物行组织学及免疫荧光分析软骨标志物GAG、COL2A1，骨标志物钙结节、OCN在复合物内的形成情况，我们仅发现软骨段内有软骨标志物生成，成骨段内有骨标志物生成，未发现有明显的交叉或重叠区域。此外，无特异性的纤维生成段内，新生的相互连接的胶原纤维明显缩小了支架的孔径及孔隙率，有效地修复了纤维生成段的胶原结构。同时，我们也观察到共培养3周后的细胞－肌腱复合物实物与复合细胞前相比，表面光泽度增加，体积饱满，质地也明显增加，然而从外观上并未发现3个功能区有明显的不同(图3)。

本研究在脱细胞异体肌腱内成功复制了一种细胞间相互作用可控性、基质分布不均一性的多组织(纤维－纤维软骨－骨)过渡结构，且不需要添加特殊生长因子和复杂的干细胞诱导培养。本实验的不足之处在于异质性细胞在脱细胞支架内的分化、基质形成不显著，这可能与细胞在脱细胞支架内的生长及分化能力降低有关，后期研究可行软骨及成骨基因的转染修饰，促进骨软骨标志物在支架内的大量生成；同时，应行进一步的在体实验，验证该细胞－肌腱复合物的体内愈合效果。

（参考文献略）