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一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途 【专利摘要】本发明公开了一种深海真菌次生代谢产物中的化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途。该化合物具有如下的结构式，其分子式为C12H15ClO4，分子量为258.0659。通过接种白色侧齿霉Engyodontium?album菌丝体于海水中制备得到。该化合物具有抗菌功能，可用于制备抗菌药物。 【专利说明】一种深海真菌次生代谢产物中的化合物 Engyodont i um i nA、制备方法及其用途 【技术领域】 [0001]本发明涉及海洋微生物领域，尤其涉及一种抗菌化合物，具体为一种化合物EngyodontiuminA、制备方法及其用途。 【背景技术】 [0002]海洋微生物(marine microorganism)是指分布在海洋中的个体微小、形态结构简单的单细胞或多细胞生物；是海洋中个体微小，构造简单的低等生物的总称。包括细菌、真菌、放线菌、霉菌、酵母、病毒、衣原体、支原体、噬菌体和微型藻及微型原生动物等。 [0003]1929年，Fleming从真菌中发现青霉素开创了人类用抗生素与疾病作斗争的新纪元。人们研究热点一直是陆生真菌资源，90年代以前，关于海洋真菌的化学研究报道很少；1970-1990年，只有少数报道；但是到了 1990年以后，这方面的报道几乎呈指数性增长。到2002年从海洋真菌中共发现272个新天然产物，其中也包括了一些深海真菌中发现的天然化合物，其中许多化合物具有新的骨架。1998年和2000年发现的新化合物数目最多，近年来海洋真菌来源的新化合物数目的总趋势依然在增加，从而证明了海洋真菌具有独特的代谢和生理机制，是潜在的药物先导化合物的丰富资源。 [0004]深海真菌是指大于等于1000米水深处海洋中个体微小，结构简单的真菌。深海真菌白色侧齿霉Engyodonium album分离于大西洋(经度:W24° 23纬度:NO。8)-3542m的深海沉积物，属于深海丝状真菌。目前仅有文献报道称对黑乳海参共附生白色侧齿霉菌的次级代谢产物进行研究，分离得到一些留体成分。 【发明内容】 [0005]本发明的目的在于提供一种具有抗菌作用的新的化合物。 [0006]为实现上述目的，本发明提供一种化合物EngyodontiuminA,其特征在于,其分子式为C12H15ClO4，分子量为258.0659，具有如下结构式， [0007] 【权利要求】 1.一种化合物EngyodontiuminA，其特征在于，其分子式为C12H15ClO4,分子量为258.0659，具有如下结构式， 2.权利要求1所述化合物EngyodontiuminA的制备方法,其特征在于,包括如下步骤， 菌种的准备:使用海水PDA培养基，高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，接种白色侧齿霉Engyodontium album菌丝体培养,作为菌种；所述海水PDA培养基成分为马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g, IL海水； 发酵种子液制备:在多个锥形瓶中分别装入海水PDA液体培养基，高温灭菌后，接种上述菌种培养，将该培养物作为种子液； 接种:采用固体发酵方式，准备发酵瓶，加入大米固体发酵培养基，接种上述种子液，培养；所述大米固体发酵培养基为每IL的三角锥瓶装大米105g，小黄米45g，PDA培养基150ML，121°C，20min，高温灭菌； 萃取:待真菌发酵成熟后，加入乙酸乙酯500mL/瓶浸泡发酵产物，发酵产物溶入乙酸乙酯溶液中，浸泡后，将上层乙酸乙酯相倒出，下层为固体发酵产物；加入新的乙酸乙酯500mL/瓶，此步骤可反复多次，每次浸泡一段时间，如此制备得到乙酸乙酯初提液；以乙酸乙酯和所得到的乙酸乙酯初提液为混合溶剂，采用高压乳化切割机碾碎下层的固体发酵产物，胞内物质溶解到上述混合溶剂中，得到乙酸乙酯混合液，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯混合液减压浓缩至固态浸膏，得到初级浸膏； 单体分离纯化:所得初级浸膏与正相硅胶拌样成粉状，，将拌好的粉末样品加入空柱中待分离；将装有粉末样品的柱子与正相硅胶柱连接，利用中压液相制备系统进行洗脱，设置正己烷-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇层析比例，在中压液相制备系统中接收分离后出峰信号，根据信号峰出峰的先后顺序依次收集峰值在200mA-2000mA的洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在35摄氏度24h真空浓缩为固态浸膏，即得到初级馏分15个，编号从F.1到F.15依次编号，每个初级馏分的量约是2g-3g ； 初级馏分分别以少量甲醇溶解，加入合适的助溶剂待分离；采用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统进行梯度洗脱，根据信号峰出峰时间收集洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪在40摄氏度2-3天真空浓缩至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分，编号从N0.1到N0.88依次编号，每个次级馏分的量是20mg-300mg ； 第N0.14的次级馏分采用高效液相色谱仪处理，仪器上体现目标化合物的出峰时间在25min左右,然后采用高压反相C18制备柱制备收集得到化合物EngyodontiuminA。 3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述菌种的准备中，所述高温灭菌为121°C，20min ;所述培养为于28 °C下静置培养4-5天；任选的，所述发酵种子液制备中，高温灭菌为12rC，20min ;所述培养为28°C下以180rpm/min振荡培养2-3天； 任选的，所述接种为中种子液的接种量为15% ;28°C培养箱放置28天； 4.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述萃取中，每瓶加入乙酸乙酯500mL浸泡发酵产物，所述浸泡时间为24h，所述多次可以是三次，每次浸泡24h ;所述混合溶剂中，乙酸乙酯与乙酸乙酯初提液的体积比为2:3 ;所述减压浓缩条件为2-3h，35°C。 5.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述单体分离纯化中，所得初级浸膏与正相硅胶的重量比例为1:3左右；所述正相硅胶柱规格为43-60,60A ;所述正己烷-乙酸乙酯体积比例为80:20，60:40，40:60，20:80，0:100，所述乙酸乙酯-甲醇体积比例为70:30,0:100 ;所述洗脱液减压浓缩条件为每个样l_2h，35°C ； 初级馏分以少量甲醇溶解，比如lmL，加入四氢呋喃，500 μ L待分离；采用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，利用中压液相制备系统，设置洗脱条件为:乙腈:水=100:0-0:100梯度洗脱，根据信号峰出峰时间收集洗脱液，减压蒸馏，6-7天，40°C，至固态浸膏，得到次级馏分，共得到88个次级馏分，依次编号N0.1-N0.88。 6.权利要求1所述化合物EngyodontiuminA用于抗菌的用途。 7.权利要求6所述的用于抗菌的用途，其特征在于，所述菌为真菌和细菌。 8.权利要求7所述的用于抗菌的用途，其特征在于，所述真菌为黑曲霉。 9.权利要求7所述的用于抗菌的用途，其特征在于，所述细菌为抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，轮虫弧菌，坎式弧菌，创伤弧菌。 10.权利要求1所述化合物EngyodontiuminA用于制备抗菌药物的用途。 【文档编号】A61P31/04GK103724190SQ201310722849 【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日 【发明者】陈建明, 王伟毅, 陈卓, 李芊, 王蔚, 杨慧, 陈巧玉 申请人:国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会。 |
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