预防hiv（艾滋病）性传播的新型杀微生物剂酸酐修饰抗sevi多克隆抗体的制作方法（专利）

预防hiv性传播的新型杀微生物剂酸酐修饰抗sevi多克隆抗体的制作方法 【专利摘要】预防HIV性传播的新型杀微生物剂酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体，具有抗SEVI多克隆抗体，其中所述抗SEVI多克隆抗体通过合成SEVI多肽片段PAP248-286，使用常规方法免疫家兔或其他试验动物，收集抗SEVI抗血清，纯化抗体IgG后获得。上述抗体通过酸酐修饰后得到本发明酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体。该酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体对HIV-1假病毒株、实验室病毒株、临床分离株和抗HIV药物HIV-1耐药株均有良好的抗病毒活性，并且该酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体可以特异性结合SEVI，从而阻断精液中的SEVI对HIV病毒感染的增强作用。本发明有益效果在于，发明一种既拮抗SEVI对HIV感染的增强能力，其本身又具有高效抗HIV活性的双功能预防HIV性传播的候选杀微生物剂。 【专利说明】预防HIV性传播的新型杀微生物剂酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体 【技术领域】 [0001]本发明涉及生物化学领域，具体涉及一类可预防HIV性传播的新型杀微生物剂——酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体。 【背景技术】 [0002]艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),即人类获得性免疫缺陷综合征，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)入侵人体，持续复制和传播而导致CD4+T细胞的显著减少以及机会性感染和癌症的发生，严重威胁着世界的安全和人类的生存。截止至2012年底，世界范围内约有3540万人感染HIV。我国艾滋病的防治也处于关键时期，现HIV感染者已超过70万人，主要高发于云南、河南、新疆和广东等省份，HIV感染正处于高流行顶峰，对我国人口健康和社会经济的发展产生了巨大的影响。因此，国内外急需发展预防HIV感染的有效手段和防治方法，以达到“零”艾滋的目标，预防和治疗HIV感染也成为我国政策优先支持和重点发展的研究方向。 [0003]艾滋病的传播主要有三种途径，血液传播、性传播及母婴垂直传播。而性传播，尤其是异性间或同性间性传播已成为艾滋病传播的主要途径。理论上，HIV感染最好的预防手段是研发艾滋病疫苗。然而，自HIV发现的二十多年来，还没有一个艾滋病疫苗被临床试验证明为有效。2003年2月，以激活体液免疫、诱导产生中和抗体为目标的艾滋病疫苗AIDSVAX，因3期临床试验未能取得有效的预防作用而被宣布失败。2007年9月，以激活细胞免疫为目标的基于腺病毒载体的艾滋病疫苗Ad5HIV-lgag/p0l/nef的3期临床试验，也因未能取得有效的保护作用而被终止。因此，艾滋病疫苗的研究还需要在相关的基础研究方面取得重大突破。在今后相当长的一段时期内，有效的艾滋病疫苗还难以问世。 [0004]因此，阴道或肛门局部使用的杀微生物剂(MiciObicides)，为艾滋病的预防提供了一项新的思路和选择。杀微生物剂是一类含有抗HIV成分的凝胶，乳脂，栓剂，药膜或海绵，在性交前置入阴道或肛门内，以预防艾滋病病毒和其他性传播疾病的传播。杀微生物剂可通过直接灭活HIV、阻止HIV粘附及侵入阴道或直肠粘膜内的靶细胞、抑制HIV在靶细胞内的复制等作用机理，保护健康人群在性行为时免受HIV感染。 [0005]因此，杀微生物剂能使性伴侣即使在不使用安全套的情况下避免感染HIV。更为重要的是，杀微生物剂的使用可被女性所控制，而不需要经过性伴侣的同意，从而为女性自主预防HIV性传播提供了有效的措施。这在女性地位比较低下的发展中国家(如大部分的非洲国家)预防艾滋病非常关键。另外，杀微生物剂还可开发成具有避孕效果和不具备避孕效果的不同品种，以满足女性使用者的不同需要。对于一些希望怀孕的妇女或夫妇，不具避孕效果的杀微生物剂能使她们在不担心感染HIV的情况下受孕，而这一点则是安全套不可能提供的。为此，杀微生物剂的研究开发已被联合国艾滋病规划署(UNAIDS)和世界卫生组织(WHO)定为全球优先发展的策略。 [0006]为提高杀微生物剂预防HIV性传播的有效性，近年来开发的重点是特异性作用于HIV且机制明确的第二代杀微生物剂产品，如HIV逆转录酶抑制剂及HIV进入抑制剂。逆转录酶抑制剂作为抗艾滋病治疗药物已经有近20年的历史，目前被批准的核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂就有十余种，研究中的活性化合物则更多。它们通过抑制HIV逆转录酶的活性或中止DNA链的延长，抑制病毒的复制。一些毒性小、粘膜吸收少的逆转录酶抑制剂可作为杀微生物剂进行开发。但理论上来说，阻断病毒进入靶细胞是预防HIV感染最有效的手段，即“御敌于国门之外”。 因此，HIV进入抑制剂作为杀微生物剂具有显著的优势。 [0007]迄今为止大约有20个杀微生物剂产品已进入临床试验的各个阶段，其中7个已结束 Ilb/III 期大规模临床试验(N_9, Savvy, Ushercell, Carraguard, BufferGel, PR0-2000和Carb0p01974P)，均先后宣布失败或被中止。这些杀微生物剂大多是阴离子多聚物类，通过其所带的阴离子电荷阻止HIV包膜糖蛋白gpl20与宿主靶细胞受体结合而抑制HIV的感染。然而，目前已经结束的3个多聚阴离子类杀微生物剂(Ushercell、Carraguard和PR02000)临床研究均宣告失败，试验结论显示其用药安全但无效，甚至HIV感染率比安慰剂组略高。这些多聚阴离子类杀微生物剂临床试验失败的主要原因是什么呢？ [0008]由于杀微生物剂用药部位为阴道，其药效不能忽视精液对杀微生物剂的影响。2007年，德国Ulm大学MUnch J等人研究发现，精液中存在的前列腺酸性磷酸酶多肽片段(PAP248-286)能形成淀粉样纤维，促进HIV的感染。这一淀粉样纤维称为精液源性病毒感染增强因子，即SEVI。研究证实，SEVI促进HIV病毒感染可能的作用机理主要是其形成的淀粉样纤维具有极强的阳离子特性，能通过两种方式增强HIV感染:1)降低HIV病毒颗粒与靶细胞之间的静电排斥；2)捕获HIV病毒，提高其在靶细胞表面的沉降速率，协助病毒与宿主细胞相互作用，由此导致病毒粒子与靶细胞吸附显著增加。我们的前期研究发现，SEVI极有可能是导致多聚阴离子类杀微生物剂临床试验失败的主要原因(PLoS One, 2013) 0 [0009]以上发现对未来杀微生物剂的研发具有重要的理论指导意义，为临床新型杀微生物剂的研发提供新的作用靶点，同时具有拮抗SEVI增强HIV病毒感染的能力及抗HIV病毒的活性的候选药物可能是临床杀微生物剂未来研发方向之一。这也为本发明候选杀微生物剂的研究提供了理论依据。 [0010]1995年,美国纽约血液中心的Neurath AR和姜世勃等人的研究发现:一系列经不同酸酐修饰的蛋白，均具有抑制HIV病毒进入靶细胞的作用，使无活性的蛋白产生抗HIV活性。近年来，本发明人所在的课题组选用不同酸酐修饰卵清蛋白(Ovabumin, OVA),制备了两种酸酐修饰卵清蛋白HP-OVA及ML-0VA，均能高效抑制多种HIV病毒株的感染，其机理是干扰gpl20与⑶4受体的相互作用，从而抑制HIV进入靶细胞。 [0011]但是，HP-OVA及ML-OVA也是带负电荷的杀微生物剂，可能也会像临床试验失败的多聚阴离子类杀微生物剂一样，因为促进精液SEVI淀粉样纤维结构的形成，而降低自身抗HIV活性，从而导致未来临床试验的失败。 [0012]前期，发明人曾酸酐修饰过兔抗HIV_lgp41多克隆抗体，发现酸酐修饰能显著提高该抗体的抗病毒活性，且能部分保持其抗体功能区活性。因此，本发明采用酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体，就有可能成为一种既能保持抗体功能区活性从而拮抗SEVI增强病毒感染作用，其本身又具有高效抗HIV活性的双功能候选杀微生物剂，从而最大程度地避免未来临床试验时因精液中SEVI的存在而导致临床试验失败的可能。这种酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体可有望解决目前阴离子多聚物类杀微生物剂研发所面临的困难，成为一种理想的杀微生物剂。  【发明内容】  [0013]本发明旨在于提供一种可预防HIV性传播的新型杀微生物剂——酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体，利用SEVI免疫家兔等试验动物得到抗SEVI多克隆抗体，能够通过其抗体功能区与SEVI淀粉样纤维特异性结合，从而拮抗SEVI增强病毒感染的作用。但抗SEVI多克隆抗体自身没有抗病毒活性。本发明进一步针对抗SEVI多克隆抗体进行酸酐修饰，能显著提高该抗体的抗病毒活性， 并且部分保持其抗体功能区活性，使其成为既能保持抗体功能区活性从而拮抗SEVI增强病毒感染作用，其本身又具有高效抗HIV活性的双功能候选杀微生物剂，从而最大程度地避免未来临床试验时因精液中SEVI的存在而导致失败的可能性。本发明的酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体解决了目前阴离子多聚物类杀微生物剂研发面临的困难，有望成为一种理想的杀微生物剂。 [0014]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下: [0015]预防HIV性传播的新型杀微生物剂酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体，具有抗SEVI多克隆抗体，其中所述抗SEVI多克隆抗体通过合成形成SEVI淀粉样纤维的多肽片段PAP248-286，使用常规方法免疫家兔等试验动物，收集抗SEVI抗血清，纯化抗体IgG后获得，所述酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体通过以下步骤制备: [0016](I)选用酸酐化合物溶于二甲基亚砜中，并达到饱和状态； [0017](2)将所述兔抗SEVI多克隆抗体溶于pH8.5,0.1M的磷酸钠缓冲溶液，并维持浓度为 3mg/mL ； [0018](3)将所述饱和酸酐溶液分为五等份，并定时加入所述步骤(2)的溶液中，维持混合液为pH8.5，终浓度60mM; [0019](4)使所述混合液为25°C,静止放置Ih后,使用PBS透析过夜； [0020](5)将所述透析液经PD-10脱盐层析柱脱盐处理，经0.45 μ m微孔滤膜过滤除菌； [0021](6)将获得的酸酐修饰抗SEVI多克隆抗放置在4°C保存。 [0022]作为一种优选的方案，所免疫的动物可为小鼠、大鼠及狗等试验用动物。所制备抗体可为单克隆抗体及多克隆抗体。 [0023]作为一种优选的方案，所述酸酐修饰化合物可为3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、顺式乌头酸酐、偏苯三甲酸酐、1，2，4_苯甲酸酐等中的一种。 [0024]为了进一步实施，本发明还提供一种使用酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体制备预防HIV性传播的杀微生物剂的方法，所述杀微生物剂包括:酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体lg，卡波姆-94010g,丙二醇50g,三乙醇胺1.5g,加入蒸懼水定容至1000mL。共制备阴道/肛门用凝胶栓剂1000个，每个含该化合物lmg。 [0025]一种制备上述预防HIV性传播杀微生物剂的方法，所述方法包括: [0026]称取酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体lg，加入处方量的卡波姆-940混合均匀，并慢慢加至适量的蒸馏水中，充分搅拌，使溶胀、分散均匀，加0.1M三乙醇胺调节其pH值在5~6之间，搅拌均匀；称取丙二醇和适量水，水浴加热溶解，再加入上述卡波姆基质中制成透明凝胶基质，分装后即可获得。 [0027]本发明有益效果在于，富含赖氨酸的抗SEVI (精液源性病毒感染增强因子)多克隆抗体蛋白被赖氨酸修饰物如芳香族酸酐化合物修饰后，该类酸酐修饰的多克隆抗体可有效预防HIV病毒感染，并且阻断SEVI对HIV感染的增强能力，其本身又具有高效抗HIV活性的双功能候选杀微生物剂，从而最大程度地避免未来临床试验时因精液中所存在的SEVI而导致的失败，是一种理想的杀微生物剂。 【专利附图】  【附图说明】 [0028]图1为本发明酸酐 修饰抗SEVI多克隆抗体体外抗HIV-Li假病毒活性数据图示； [0029]图2为本发明酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体与PAP特异性结合数据图示； [0030]图3为本发明酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体与SEVI特异性结合数据图示。 [0031]图4为本发明酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体体外拮抗SEVI增强病毒感染能力的数据图示。 【具体实施方式】 [0032]下面将结合附图对本发明作进一步的描述。需要说明的是，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 [0033]本发明为预防HIV性传播的新型杀微生物剂酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体，具有抗SEVI多克隆抗体，其中所述抗SEVI多克隆抗体通过合成形成SEVI淀粉样纤维的多肽片段PAP248-286，使用常规方法免疫家兔等试验动物，收集抗SEVI抗血清，纯化抗体IgG后获得，所述酸酐修饰兔SEVI多克隆抗体通过以下步骤制备: [0034](I)选用酸酐化合物溶于二甲基亚砜中，并达到饱和状态； [0035](2)将所述抗SEVI多克隆抗体溶于pH8.5,0.1M的磷酸钠缓冲溶液，并维持浓度为3mg/mL ； [0036](3)将所述饱和酸酐溶液分为五等份，并定时加入所述步骤(2)的溶液中，维持混合液为pH8.5，终浓度60mM; [0037](4)使所述混合液为25°C,静止放置Ih,使用PBS透析过夜； [0038](5)将所述透析液经PD-10脱盐层析柱脱盐处理，经0.45 μ m微孔滤膜过滤除菌； [0039](6)将获得的酸酐修饰抗SEVI多克隆抗放置在4°C保存。 [0040]需要说明的是，纯化抗体IgG为现有的常规方法。 [0041]作为一种优选的方案，所免疫的动物可为小鼠、大鼠及狗等试验用动物。所制备抗体可为单克隆抗体及多克隆抗体。 [0042]作为一种优选的方案，所述酸酐修饰化合物可为3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、顺式乌头酸酐、偏苯三甲酸酐、1，2，4_苯甲酸酐等中的一种。 [0043]为了更好的理解本发明，下面对本发明酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体体外抗HIV活性及拮抗SEVI增强病毒感染的能力进行说明，为了简便，下面的说明以3-羟基-邻苯二甲酸酐修饰的兔抗SEVI多克隆抗体(HP-API)为例，进行说明。 [0044]一、酸酐修饰兔抗SEVI多克隆抗体(HP-API)体外抗HIV活性 [0045]本发明检测了该酸酐修饰兔抗SEVI多克隆抗体对HIV假病毒以及主要的HIV实验室及临床病毒株的抗病毒活性。实验数据表明，本发明对HIV假病毒以及主要的HIV实验室及临床病毒株均有良好的抗病毒活性，并且对T-20耐药株以及抗逆转录病毒抑制剂耐药株也具有良好的抗病毒活性。 [0046]1、酸酐修饰兔抗SEVI多克隆抗体体外抗假病毒活性。 [0047]如图1所示，本发明检测了酸酐修饰兔抗SEVI多克隆抗体体外抗HIV-1jm假病毒活性，其半数抑制浓度(IC5tl)值为0.300±0.091 (μ g/mL)。 [0048]2、本发明酸酐修饰兔抗SEVI多克隆抗体体外抗主要HIV-1实验室及临床株活性。 【权利要求】 1.预防Hiv性传播的新型杀微生物剂酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体，具有抗SEVI多克隆抗体，其特征在于，所述抗SEVI多克隆抗体通过合成产生SEVI淀粉样纤维的多肽片段PAP248-286，使用常规方法免疫家兔等试验动物，收集抗SEVI抗血清，纯化抗体IgG后获得。通过化学方法进行酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体。所免疫的动物可为小鼠、大鼠及狗等试验用动物。所制备抗体可为单克隆抗体及多克隆抗体。 2.根据权利要求1所述的酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体，其特征在于，进行酸酐修饰的化合物可为3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、顺式乌头酸酐、偏苯三甲酸酐、1，2，4-苯甲酸酐等中的一种。 3.一种根据权利要求1所述的酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体制备的预防HIV性传播的杀微生物剂，其特征在于，所述杀微生物剂具有高效的抗HIV病毒活性，该酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体对HIV-1假病毒株、实验室病毒株、临床分离株和抗HIV药物HIV-1耐药株均有良好的抗病毒活性，并且该酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体可以特异性结合SEVI，从而拮抗精液中的SEVI对HIV病毒感染的增强作用。 4.一种根据权利要求3所述的预防HIV性传播的杀微生物剂，其特征在于，所述杀微生物剂包括:酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体lg，卡波姆_94010g，丙二醇50g，三乙醇胺1.5g，加入蒸懼水定容至lOOOmL。 可制备阴道/肛门用凝胶栓剂1000个,每个含化合物lmg。 5.一种制备权利要求3所述的预防HIV性传播杀微生物剂的方法，其特征在于，所述方法包括: 称取酸酐修饰抗SEVI多克隆抗体lg，加入处方量的卡波姆-940混合均匀，并慢慢加至适量的蒸馏水中，充分搅拌，使溶胀、分散均匀，加0.1M三乙醇胺调节其pH值在5~6之间，搅拌均匀；称取丙二醇和适量水，水浴加热溶解，再加入上述卡波姆基质中制成透明凝胶基质，分装后即可获得。 【文档编号】A61P31/18GK103736100SQ201310728195 【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日 【发明者】李琳, 张萱萱, 陈金拳, 裘佳寅, 段江曼, 刘叔文 申请人:南方医科大学。