1型糖尿病细胞疗法的现状与未来

文章来源：中华糖尿病杂志,2020,12 (02): 69-72

作者：陆婧 朱大龙

单位：南京大学医学院附属鼓楼医院

摘要

1型糖尿病（T1DM）是由T淋巴细胞介导的胰岛β细胞特异性免疫损伤而致胰岛素绝对缺乏，进而引起血糖升高。胰岛素替代是目前临床主要的治疗方法，虽能控制高血糖，但不能遏制胰岛功能进行性衰竭，无法有效阻止糖尿病相关并发症的发生。细胞疗法基于T1DM病理生理特征，旨在通过胰岛β细胞替代或再生治疗保护甚至重建内源性胰岛素分泌系统，从而改善疾病进程与预后，是T1DM治疗领域备受关注的研究方向。本文将围绕胰岛移植与多能干细胞在T1DM治疗中的研究现况及发展方向进行论述。

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）是胰岛β细胞特异性免疫损伤致胰岛素绝对缺乏的自身免疫性糖尿病。细胞疗法基于T1DM病理生理特征，旨在通过胰岛β细胞替代或再生治疗保护甚至重建内源性胰岛素分泌系统，从而改善疾病进程与预后，是T1DM治疗领域备受关注的研究方向。笔者将围绕胰岛移植与多能干细胞在T1DM治疗中的研究现况及发展方向进行论述。

一、胰岛移植与胰岛功能重建

胰岛移植通过植入正常胰岛细胞增加糖尿病患者体内的胰岛素分泌细胞数量，从而实现胰岛功能的重建。早期Edmonton方案中，T1DM受者移植2年后的胰岛素脱离率仅14%^[1]。近年，美国临床胰岛移植协会通过优化免疫抑制及抗凝、抗血小板等治疗方案，胰岛素脱离比例已提升至42%^[2]。部分研究报道的5年胰岛素脱离率达50%以上^[1]。重建的内源性胰岛功能有益于T1DM血糖平稳达标。70%受试者在移植后2年仍维持糖化血红蛋白达标且无低血糖发生^[2]。美国糖尿病学会推荐，T1DM经严格血糖管理仍反复严重低血糖且合并低血糖感知受损者，或肾移植同时或移植后血糖控制不达标者可考虑胰腺或胰岛移植治疗。目前，该技术在加拿大、英国、法国等国家已纳入了医疗保障范畴。

胰岛移植是实现胰岛功能重建最具潜力的治疗方法，未来需着眼以下问题进一步探索与突破：（1）满足临床胰岛供给需求：目前大部分研究报道的平均移植胰岛数量大于8 000 IE/kg，亟需发展新技术解决胰腺供体短缺的现状，将干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞是解决临床胰岛来源颇具前景的研究方向。（2）保护移植胰岛的功能：分离后的胰岛经历了多种体内外应激损伤，要有效保存移植胰岛的功能、降低无功能的发生，需在每一个技术环节上精益求精，包括优化胰岛分离纯化技术，维持围手术期的体内代谢稳态，确立最佳移植部位及改进免疫抑制方案。（3）优化免疫耐受的诱导策略：安全有效的免疫抑制方案既要有效对抗异体免疫排斥与胰岛自身免疫反应，又需尽量减轻对胰岛的毒副作用，探索不同免疫抑制剂联合方案、研发新型免疫抑制剂及免疫隔离技术有望为优化免疫治疗方案提供新思路。

二、多能干细胞诱导分化与胰岛功能重建

1．胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）：

ESC是起源于胚胎内细胞团的原始细胞，可分化为内、中、外三胚层的组织细胞，是胰岛β细胞再生治疗中最具潜力的种子细胞。2006年，D′Amour等^[3]首次将人ESC在体外分化为胰岛素分泌细胞。此后，ESC体外培养方案不断改良，体外诱导分化效率由7%逐步提高至33%~50%，移植小鼠体内可发挥与人胰岛细胞相近的生物学效应，2周后观察到葡萄糖依赖的胰岛素分泌反应，8~12周后糖尿病小鼠的血糖恢复至正常^[4]。最近，Melton课题组通过细胞再聚集与抗CD49a磁珠筛选两步富集法，将胰岛β样细胞分离纯度进一步提升至80%^[5]。然而，ESC来源β样细胞与原代人胰岛细胞的基因表达谱、微观结构、胞内钙离子浓度等仍有差异，需深入探索胰岛β样细胞分化发育的关键调控分子，优化不同诱导因子或小分子物质的组合方案，以更精准地调控ESC分化。此外，如何优化不同内分泌细胞的组成比例、更好地模拟人胰岛解剖生理也是未来研究亟待解决的问题。

另有研究将ESC体外分化至胰腺前体细胞后移植体内，通过体内微环境促其分化成熟。与ESC来源的β样细胞相比，胰腺前体细胞的体外分化率高，体内组织耗氧率低、存活率较高，但需经历较长时间的体内分化发育过程^[6]。既往研究显示，胰腺前体细胞移植至小鼠体内后2~3个月分化成胰岛样组织，可有效防治糖尿病的发生与进展^[7]。然而，移植小鼠中15%~45%并发了畸胎瘤样病变。鉴于胰腺前体细胞的免疫原性及潜在致瘤性，美国ViaCyte公司研发了双层膜结构的包囊装置，将人胰岛前体细胞包裹后植入皮下（PEC-Encap^TM），从而发挥免疫隔离作用^[8]。后续研发的PEC-Direct^TM在上述装置的基础上增加了促植入细胞血管化体系，以期改善移植物血供及提高存活率。目前，PEC-Encap^TM及PEC-Direct^TM均已获得美国食品药品监督管理局批准用于T1DM治疗的临床Ⅰ/Ⅱ期研究（NCT02239354，NCT03163511），上述研究将为其临床安全与疗效提供重要依据。

2．诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）：

iPSC是通过体外重编程已分化的体细胞而获得的一种类似ESC的多能干细胞，有效解决了ESC来源受限及伦理学争议问题。近年，小分子化合物化学重组及非整合质粒转染等技术的应用在一定程度上降低了iPSC成瘤风险^[9]。此外，由于iPSC可源自患者的任何一种组织细胞，其突出优势在于可分化获得自体胰岛β样细胞，从而减轻移植物的免疫排斥损伤。有研究证实，T1DM患者皮肤成纤维细胞重编程获得的iPSC具备与健康供者来源iPSC相同的生物学效能，分化形成的胰岛β样细胞移植至小鼠体内，可有效预防胰岛损伤及血糖升高^[10]。然而，自体iPSC来源的胰岛β样细胞的免疫原性及成瘤性仍有待长期随访研究明确。目前，日本学者已率先将iPSC来源的视网膜色素上皮细胞用于治疗黄斑变性的临床研究，开启了干细胞库治疗人类疾病的新局面^[11]。

由上可见，利用ESC或iPSC实现胰岛再生正展现出广阔的研发应用前景，未来研究在不断提高多能干细胞靶向诱导分化效率的同时，尚需解决以下问题：（1）免疫排斥与自身免疫反应：ESC来源的胰腺前体细胞及胰岛β样细胞均存在不同程度的免疫原性；自体iPSC的分化产物也同样存在诱发排异反应风险^[12]，可能与基因重编程所致的遗传或表观遗传变异、自身抗原异常表达有关。此外，胰岛β样细胞移植至T1DM体内后可能再次触发胰岛特异性免疫损伤。基于人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型寻找供体细胞、优化免疫耐受诱导方案、改良包囊式免疫隔绝技术有望提供有效解决方法。（2）移植物的远期安全性：ESC和iPSC体外终末分化产物中混杂的未成熟细胞是移植后致瘤的潜在来源，并且细胞重编程及诱导分化本身也会导致拷贝变异增加。因此，研发安全稳定的重编程及诱导技术、提高终末分化产物纯度、完善细胞安全性检测及评价体系、采用移植物局部隔离等措施，有可能提高多能干细胞治疗的安全性。

三、通过多能干细胞改善免疫微环境修复胰岛功能

1．造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）：

HSC是所有血细胞和免疫细胞的起源，具有极强自我更新能力与多向分化潜能，广泛应用于血液系统疾病以及自身免疫疾病的临床治疗与研究。本课题组是全球较早开展非清髓自体外周造血干细胞移植治疗T1DM的研究中心之一^[13]。2014年，包括本课题组在内的三家研究中心汇总65例T1DM患者、平均48个月的随访数据，进一步证实自体骨髓造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHST）可诱导59%患者实现临床完全缓解，平均脱离胰岛素12个月^[14]。AHST的疗效机制主要与诱导机体免疫耐受及修复受损胰岛有关，HSC移植后是否能定向分化为胰岛β样细胞尚缺少研究证据。

HSC是最早应用于T1DM临床治疗的干细胞类型，要进一步实现临床推广应用尚须解决以下问题：（1）提高HSC移植安全性：Meta分析显示其不良反应发生率达52%，主要累及骨髓、消化道及免疫系统，国外有绿脓假单胞菌败血症致死的病例报道^[13]。近期，有研究通过改良非清髓预处理方案，显著减少了副反应发生，所有受试者均在移植门诊完成治疗^[15]。因此，优化技术方案、提高安全性是推动其临床转化的关键。（2）确立适应证人群：既往研究报道提示非清髓自体外周造血干细胞移植的临床疗效存在异质性，年龄、病程、糖尿病酮症酸中毒（diabetic ketoacidosis, DKA）病史、基线胰岛功能、胰岛自身抗体数目是影响疗效的潜在因素^[14]，有待于更多的前瞻性研究为预测疗效及规范临床应用的适应证提供科学依据。

2．间充质干细胞（mesenchymal stromal/stem cell，MSC）：

MSC最初由Caplan于1991年从骨髓中分离鉴定并命名。此后，MSC从脐带、脐血、脂肪、羊水、牙髓等多种组织中被分离，并广泛地应用于多种疾病的研究与转化应用。2018年Nature评论文章对MSC的多能干性及其定义精确性提出质疑，指出大部分研究缺乏对MSC分子鉴定的一致性，而不同组织来源的MSC在基因表达和分化潜能等方面存在较大差异^[16]。该篇文章促使学者们重新审视MSC的发现与研究历程，思考MSC生物学功能的共性与异质性问题，探索如何细化MSC分类并更精准地用于疾病治疗。

既往国内外多项基础研究采用不同来源的MSC干预非肥胖糖尿病（no obesity diabetes, NOD）小鼠均证实，MSC可预防、延缓甚至逆转自身免疫性糖尿病的发生发展。多数研究认为MSC在体内不能分化为胰岛素分泌细胞，其疗效机制主要与MSC的组织归巢、损伤修复、免疫调节特性有关^[17]。本课题组研究显示，骨髓MSC经尾静脉输入NOD糖尿病小鼠后，在胰腺中的分布量较高、驻留时间较长，提示MSC可向受损胰岛归巢；免疫学机制研究进一步证实，骨髓MSC显著增加胰岛及外周循环中的调节性T细胞数量，纠正促炎/抗炎细胞因子失衡，从而缓解胰岛炎，改善胰岛功能及血糖^[18]。

基础研究进一步推动了临床转化，目前Clinical Trials注册的MSC治疗T1DM的临床试验近15项。Carlsson等^[19]研究显示，较之常规胰岛素治疗，单次自体骨髓MSC移植可有效保护残存胰岛功能，但两个治疗组的血糖控制及胰岛素剂量差异均无统计学意义。Hu等^[20]采用单次异体脐带MSC移植治疗初发T1DM，移植组的胰岛功能较基线增加50%以上，显著高于胰岛素治疗组，有3例（20%）停用胰岛素。本课题组采用单次异体脐带MSC移植治疗17例酮症酸中毒起病的T1DM，随访2年期间，53%受试者胰岛功能较基线增加30%以上，但无受试者脱离胰岛素^[21]。基于同期的基础研究结果，我们增加了移植疗程，目前正在开展异体脐带MSC重复移植治疗初发T1DM的非随机平行对照研究，初步数据分析显示该疗法有助于保护T1DM患者的残存胰岛功能，有2例受者脱离胰岛素近1年。

由上可见，临床研究的疗效呈现较大异质性，可能与各中心的受试者人群特征、MSC类型、治疗方案等不同有关。因此，未来的研究尚需探讨阐明以下问题：（1）基于2006年国际细胞治疗协会关于MSC鉴定标准，探寻新的特征性分子标志物以提高其定义精确性，尤其需要阐明不同组织来源MSC在遗传学、表观遗传学及生物功能方面的异质性；（2）根据不同组织来源MSC的生物学异质性，深入基础及临床前期研究，确定对改善胰岛免疫微环境、促进β细胞再生最适宜的MSC类型；（3）开展高质量规范化临床研究，确立MSC治疗T1DM的适应证、移植细胞量与途径、治疗频次等，为推动临床转化应用提供科学依据。

四、细胞疗法在未来T1DM精准治疗中的应用

一个世纪以前，胰岛素的发现将T1DM由一种快速致死性的不治之症变为了可控性的慢性疾病。此后，随着人们对T1DM病程进展的深入认识、生物信息学及医药技术快速发展，T1DM的治疗理念从单纯控制高血糖逐步提升至力求血糖平稳达标及防治慢性并发症。2018年美国糖尿病学会指南确立的T1DM临床分期方法进一步推动了T1DM的早期筛查、诊断与防治研究。因此，迫切需要建立能靶向T1DM病理生理机制、针对不同个体以及不同病程阶段的治疗策略。

细胞疗法着眼于T1DM发生进展的两大核心机制，发挥胰岛β样细胞替代或者免疫调节的治疗效应，在未来T1DM精准治疗中将占有重要的一席之位。胰岛移植通过植入人胰岛细胞直接实现细胞水平的胰岛功能重建，多能干细胞中的ESC与iPSC通过体外诱导分化为胰腺前体细胞或胰岛β样细胞为胰岛移植提供重要的细胞来源，HSC与MSC则主要通过诱导免疫耐受及免疫调节效应为胰岛β样细胞存活提供良好内环境。不同类型细胞疗法的联合，或细胞疗法与降糖药物或免疫抑制类药物的联合，可能在疗效机制上实现优势互补，从而提高疗效、遏制甚至逆转疾病进程^[22,23,24]。

近10年来，T1DM细胞疗法取得了诸多突破性进展和鼓舞人心的成果，为未来T1DM个体化阶段化精准治疗提供了新思路。需要强调的是，胰岛移植目前仅针对少数T1DM患者有绝对适应证，而干细胞治疗技术仍处于临床研究阶段，细胞疗法尚不能作为常规临床实践广泛开展。随着细胞疗法相关技术不断优化，治疗安全性与疗效逐步提高，临床循证依据不断累积，细胞疗法将有望更广泛地应用于T1DM临床治疗，为广大患者带来福音。

来源：中华糖尿病杂志