miRNA研究搭上m6A的热点，申请基金不用愁。

我感觉讲miRNA有一定意义，因为过去10年很多小伙伴的课题组都研究过miRNA，为了保持课题的延续性，从RNA甲基化角度继续研究过去的miRNA指标可能是一个不错的思路。

接下来正式讲解我们的文献，作者团队来自班主任所在的南京医科大学，这篇文章的题目是：METTL14 Suppresses CRC Progression via Regulating N6-Methyladenosine -Dependent Primary miR-375 Processing。这篇文章发表在《Molecular Therapy》上，目前影响因子是：8.402。

PDF全文已经上传到公网盘，公众号主页回复“文献精读”即可获取下载链接。

先来看研究背景：

这篇文章主要介绍了METTL14通过m⁶A依赖途径影响miR-375前体成熟进而抑制结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）发展的作用机制。研究背景是分了3个部分：1. CRC的危害等背景；2. m⁶A相关基因和蛋白的介绍；3. 本研究拟开展的工作：METTL14在CRC组织和细胞中表达；METTL14在体内外对CRC表型的影响；METTL14影响表型的具体作用机制。

作者的初心我猜是想靠上研究热点m⁶A，他们是怎么靠上这个热点的，直接检测组织中METTL14的表达，直接硬靠，厉害了。

文章结果如下：

图1.  METTL14在CRC细胞和组织中低表达，METTL14高表达的患者预后良好。

图1 A：qPCR结果提示METTL14在CRC细胞中表达低于正常结直肠细胞。

图1 B：qPCR结果提示METTL14在CRC患者组织中表达低于正常组织。

图1 C：IHC结果提示METTL14在CRC患者组织中表达低于正常组织。

图1 D：生存分析提示METTL14高表达的CRC患者预后良好。

总结： 基本上就是硬靠上的研究热点m⁶A。小伙伴自己研究时最好分析下公开数据库的数据如TCGA、GEO等。不足：图1没有WB水平检测METTL14表达的结果。此外，IHC的图染的不太好。

PS：建议大家做表达检测的时候 qPCR、WB和IHC的检测结果最好都有，这样数据完整度才高。

图2.  敲低MELLT14促进CRC细胞增殖。

图2 A：检测两种不同细胞系中MELLT14的敲低效率。

图2 B：敲低MELLT14后m⁶A的水平明显降低。

图2 C-E：敲低MELLT14后促进结直肠癌进展。

总结：无。

图3.  上调MELLT14抑制CRC细胞增殖。

与图2类似，图2是抑制MELLT14表达，图3就是说明过表达MELLT14抑制CRC进展。

总结：无。

图4.  MELLT14抑制CRC细胞迁移和侵袭。

图4 就是将前面的增殖表型换成了Migration和Invasion这两个实验。

总结：无。

图5.  MELLT14在裸鼠中发挥抑癌作用。

图5 结果和前面一致。

总结：无。

中期总结：全文共8个图，前5个图主要讲了两件事：

1. MELLT14在CRC组织和细胞中低表达且与患者预后良好有关。

2. MELLT14在体内外发挥抑癌作用。

接下来终于到了m⁶A如何和miRNA结合起来的，也是本文的重点。作者前期已经确定了作为m⁶A writer的MELLT14在CRC中发挥抑癌作用，接下来要探索METTL14调节的潜在下游miRNA。

想了解图6需要学习一下其他的知识，如miRNA 的成熟加工过程：

EGCR8作为Drosha的主要结合蛋白，可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合，招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切，生成pre-miRNA，pre-miRNA进一步被Dicer酶加工剪切，形成成熟的miRNA。

我猜这个作者团队是学的这篇论文的思路PMID ：25799998。这篇文献报道m⁶A修饰可加速pri-miRNA 的成熟。

图6.  METTL14通过 m⁶A甲基化通过DGCR8影响miR-375的成熟。

图6 A：通过LinkedOmics database数据库分析发现与METTL14表达呈正相关的9个 miRNA。

图6 B：验证全部miRNA是否与METTL14表达呈正相关，敲低METTL14表达后只有miRNA-375和miR-200a表达下调，其余7个miRNA无差异表达。

图6 C：过表达和敲低METTL14后，miRNA-375和miR-200a表达分别上调和下调。

图6 D：过表达和敲低METTL14后，primiRNA-375表达有改变（总之就是和miRNA-375变化趋势相反），primiRNA-200a表达无改变。作者选择miR-375进行后续深入研究。

图6 E：之前有文献报道m6A修饰可促进primiRNA成熟，经生信预测primiRNA-375存在一个潜在可发生m⁶A修饰的A，将此位点突变为T后，成熟的miRNA-375表达降低。这些数据说明primiRNA-375的位点A可能存在m⁶A修饰，且此修饰促进primiRNA-375成熟，增加了miR-375表达。

图6 F：做RIP实验（IP抗体为DGCR8）。与对照组相比，转染METTL14组后。DGCR8蛋白富集到的primiRNA-375显著提高。意味着有更多的primiRNA-375被DGCR8加工成miR-375。和图6 C和图6 D的结果一致拉。

图6 G：做MeRIP实验（IP抗体为m⁶A）。与对照组相比，转染METTL14组的primiRNA-375的m⁶A修饰水平显著提高。

总结：这块是文章的重点，这块的理解需要学一下miRNA从primiRNA到成熟miRNA 的加工过程。我之前也不是很熟悉这块，也是现学现卖，如果哪里讲的不对请指正。我的经历告诉小伙伴们我们学习文献不可能啥都会，很多时候需要自己先查一些知识来理解文献的思路。基本上这个文章把这个图学会了就是成功，其他图都是传统的套路。

图7 .  METTL14通过影响miR-375发挥抑癌作用。

图7 A-C：miR-375在患者组织较正常组织低表达；高表达miR-375的患者预后良好；METTL14和miR-375呈正相关。

图7 D-M：METTL14通过影响miR-375发挥抑癌作用。

总结：无。

很多其他文献报道了miR-375的靶基因包括YAP1，SP1，AEG1， PDK1， IGF1R和JAK2等基因。作者想探索METTL14是否影响miR-375下游靶基因的表达。

图8. METTL14通过miR-375/YAP1 and miR-375/SP1 通路在CRC中发挥抑癌作用。

图8 A：qPCR检测结果提示METTL14过表达后促进miR-375表达。

图8 B：WB检测结果提示METTL14抑制miR-375下游靶基因YAP1和SP1的表达。

图8 C：将之前裸鼠成瘤实验中的组织包成蜡块，shMETTL14组较shNC组中的YAP1和SP1表达高，过表达组反之亦然。

图8 D：验证了其他文献中报道的miR-375可抑制YAP1和SP1的表达。

图8 E：对图8 A的回复实验。

图8 F-I：METTL14通过miR-375/YAP1 and miR-375/SP1 通路在CRC中发挥抑癌作用。

总结：无。

不足：这个图的给我的感觉就是凑数，做的不认真哈。应该单独做一做过表达和敲低后YAP1和SP1对CRC表型的影响。miR-375通过YAP1和SP1影响CRC表型。最后再做METTL14通过YAP1和SP1影响CRC表型是不是更好。

全文总结：

选择此论文原因：

我认识的很多人在过去10年都研究过miRNA。这些人大部分都转向了LncRNA和circRNA的研究。2015-2018年期间有些小伙伴及时转向了LncRNA和circRNA的ceRNA机制，大多数人都中了有关ceRNA机制的国自然。但是2020年再做ceRNA机制就不太合适拉，可以将过去的miRNA和外泌体、可变剪接等方向结合，当然m⁶A也是一个不错的思路。我讲此文仅希望给大家提供一个潜在思路。

我学到的知识：

1. 整体来说，文章的配色不错，值得学习。

2. 这篇文章严格意义上讲是一篇涉及两个主变量的文章，两个主变量分别为METTL14和miR-375。第一个主角METTL14就是硬靠。我不建议这样做，这样的做法现在能发8分，以后5分都够呛。第二个主角miR-375是公开数据库的生信分析+低通量验证，这个思路值得学习。

3. 表型检测最好是过表达和敲低都做，这篇文章做的很好。

4. 检测上游基因是否影响下游基因（如YAP1，E-cad等）的表达很有必要，毕竟很多下游基因编码的蛋白是真正发挥作用影响疾病表型的。

其他感受：

1. 这篇文章看起来不太难，但是人家就在2020年2月发表在了8分多的杂志上。为什么思路不难的文章也能发高分？

我的理解：本文之所以能发8分多，就是因为作者研究的是热点m⁶A，我两三个月前真看过一篇工作量相当的关于细胞周期研究的文章，也是8个图只发了3.8分，这就是蹭热点的重要性。这提示我们今后做研究尽量早点结合热点，行动晚了就不好说了，而且后做的门槛会越来越高。我们写基金也不能盲目追热点，没有前期基础也很难中标的。

2. 我们不应该盲目追求一个文章涉及多个指标的间接作用，例如A-B-C-D-E信号通路影响某疾病的某表型，然后每个环节都做的不细致。我们应该立足两三个指标，把每个指标的具体功能和两两之间的关系作完整做细致。这篇8分文章在这方面做的很好，值得我们学习。

3. 截止目前，miRNA和m⁶A结合起来研究的文章不太多，我目前没查到5篇，南京医大很多团队偏爱这个方向哈，我本来打算讲另一篇同样来自南京医科大学的论文（PMID：31228940），有感兴趣的小伙伴可以自己读一读。

部分miRNA和m⁶A结合相关的国自然基金名称：

1. ALKBH5调控Pri-miR-21的m⁶A甲基化促进胰腺癌化疗敏感性的机制研究（上海交通大学，2018年）

2. METTL3通过介导pri-miR-145的m⁶A甲基化抑制肾癌恶性进展的机制研究（南京医科大学，2017年）

3. METTL14通过介导pri-miR-17的m⁶A修饰促进心肌梗死后心肌细胞增殖的机制研究（南京医科大学，2018年）

以上就是关于miRNA与m⁶A研究结合的文献分享，希望对大家有所帮助。

本文作者

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