他山之石 | 揭示植物激素与种子活力的故事

水稻OsIAGLU通过IAA和ABA来调控种子活力

研究背景

      2020年2月3日，华南农业大学农学院王州飞课题组在Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Indole-3-acetate beta-glucosyltransferase OsIAGLU regulates seed vigor through mediating crosstalk between auxin and abscisic acid in rice”的研究论文。该研究揭示了OsIAGLU基因调控水稻种子活力的作用机理，同时为该基因在今后种子活力遗传改良中的应用提供重要线索。

      植物激素糖基转移酶具有平衡体内激素含量的作用，在调控植物生长发育过程中发挥着重要作用，但是其在种子活力调控中的作用鲜有报道。本研究初步阐明了水稻吲哚乙酸糖基转移酶基因OsIAGLU 通过调控种子萌发过程中生长素（IAA）、脱落酸（ABA）含量，引起下游ABA信号因子OsABIs 表达变化，决定水稻种子活力水平；同时部分解释籼稻种子活力高于粳稻的原因。

研究思路

研究结果

1. 表型观测—比较突变体与WT的表型：OsIAGLU突变导致种子活力降低

        水稻OsIAGLU位于第11号染色体上，推测含有504个氨基酸。系统发育树表明亲缘关系与玉米中的IGAU较近。为了进一步确认OsIAGLU功能，利用CRISPR / Cas9构建了osiaglu-1、osiaglu-2 和osiaglu-3突变体。3个突变体 OsIAGLU外显子都有不同的缺失。突变体与野生型相比，种子的籽粒长度、宽度、厚度和重量没有显著差异。但突变体发芽势、发芽指数、幼苗活力及幼苗根长、茎长和干重显著降低，说明OsIAGLU可能在水稻种子活力调控中具有重要作用。

图1. 突变体种子活力的比较

2. 基因表达分析—亚细胞定位和表达模式分析：OsIAGLU在细胞质中表达

      RT-PCR显示，水稻开花后0 ~ 28天灌浆籽粒中OsIAGLU的表达量逐渐增加， 28天后增加最显著；种子萌发阶段吸胀4h时OsIAGLU表达量较高。用IAA、ABA和GA处理萌发的种子，发现IAA和ABA可诱导OsIAGLU表达。GUS染色及亚细胞定位实验表明，OsIAGLU在细胞质中特定表达。

图2. OsIAGLU表达模式和亚细胞定位

3. 基因功能分析—转录组KEGG富集和激素检测：OsIAGLU调控IAA和ABA含量水平

      全转录组显示，在osiaglu-2和WT之间共鉴定了9121个差异表达基因。其中，与WT相比，osiaglu-2中有3148个基因显著上调，5973个基因显著下调。通过Mapman分析，222个差异表达基因显著富集在激素代谢通路上。其中，大多数与激素相关的DEGs参与了IAA(77)、ABA(23)、茉莉酸(JA)(22)和乙烯(ETH)(60)的代谢。

      结合之前研究报道，推测在水稻种子萌发过程中，OsIAGLU可能调控IAA和ABA的水平。对激素含量测定，发现与野生型相比，突变体种子萌发后的12-72小时内，IAA和ABA水平普遍升高。推测IAA和ABA积累量的增加可能导致种子活力降低。

图3. IAA和ABA的含量

4. 基因功能分析—外源施加激素观测突变体表型：OsIAGLU与ABA和IAA互作调控种子活力

       用5 μM和10μM外源IAA和ABA处理种子，发现外源施加IAA，对照组、野生型、及突变体种子活力（发芽时间、发芽率和发芽指数）没有明显差异。但外源施加ABA，突变体和WT植株的种子活力显著降低，且突变体种子活力最低。与ABA处理相比，IAA ABA处理显著降低了种子活力，说明外源IAA能增强ABA介导的水稻种子活力降低。水稻中敲除OsIAGLU会导致种子活力降低，是ABA和IAA过量积累及其相互作用的结果。

图4. ABA和IAA对种子活力的影响

5. 基因功能分析—转录组KEGG富集分析找通路：OsIAGLU调控种子活力与OsABIs表达相关

      RNA-Seq和RT-PCR显示IAA和ABA相关的DEGs变化趋势一致。与野生型相比，突变体在吸胀72小时ARFs (OsARF1、OsARF8和OsARF10)和ABA信号相关基因(OsABI3、OsABI5、OsZIP23、OsTRAB1和OsABL1)的转录水平显著增加。ABIs是ABA信号通路的下游因子，对种子萌发起着关键作用。观察发现，在水稻种子萌发期间，IAA和ABA处理显著诱导OsABI3和OsABI5的表达。野生型在种子萌发期OsABI3和OsABI5的表达普遍下调，而突变体在12-48 h吸胀期表现出相似的高表达模式。此外，osiaglu 突变体中OsABI3和OsABI5的表达量明显高于野生型，尤其是在种子萌发期36-72 h。这些结果表明，OsABI3和OsABI5的高表达导致水稻osiaglu 突变体植株种子活力降低。

图5. OsABIs的表达

6. 基因功能分析—等位基因启动子SNP分型：OsIAGLU变异与粳稻和籼稻种子活力差异相关

        发现籼稻种子活力强于粳稻种子活力。为了研究OsIAGLU等位基因的变化是否与两个亚种之间种子活力的差异有关，我们使用水稻材料的SNP数据分析了OsIAGLU上游2kb到下游1kb区域的SNP。在这些材料中鉴定出5个OsIAGLU单倍型。与种子高活力相关的Hap 1和Hap 2与主要存在于籼稻,与种子低活力相关的Hap 3、Hap 5主要存在于粳稻和Hap 4两者都有。与Hap 3、Hap 4或Hap 5相比，Hap 1和Hap 2水稻中OsIAGLU的表达量明显较高。总之，OsIAGLU变异与粳稻和籼稻种子活力差异相关。

图6. Hap的情况

小结

研究目的: 种子活力是影响直播稻生产的重要性状，植物激素糖基转移酶具有平衡体内激素含量的作用，在调控植物生长发育过程中发挥着重要作用，但是其在种子活力调控中的作用鲜有报道。本文对激素调控水稻种子活力的作用机理进行了探究。 

研究结果：研究人员利用构建的日本晴水稻突变体，初步阐明了水稻OsIAGLU基因通过调控种子萌发过程中生长素（IAA）、脱落酸（ABA）含量，引起下游ABA信号因子OsABIs表达变化，决定水稻种子活力水平；同时，发现水稻OsIAGLU基因在籼粳稻之间存在等位变异，引起籼稻种子萌发过程中该基因表达显著高于粳稻，可部分说明籼稻种子活力高于粳稻的原因。

点石成金：种子萌发过程中会消耗大量能量，除了植物激素发生了变化，糖、脂质等其它代谢物也发生了巨大变化，本文还可以对代谢组进行更加全面的检测。