具中科博生研究发现，单充降抗体的特异性和多样性使利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。 目前,抗体介导的细胞分离技术主要有:抗体/补体介导细胞溶瘤法、流式细胞仪细胞分选法、平面黏附分离法、免疫磁珠分离法等。从抗体介号技术获得细胞的角度看,又可分为阳性细胞选择法和阴性细胞选择法。拟从混众细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群,称为阳性细胞选择法;反之拟除去表达与抗体相应膜抗原的细胞,而收集其余的细胞群体,称为阴性细胞深择法。其中上述抗体/补体介导细胞溶解法为阴性细胞选择法,而其余3种方法既可以作为阳性选择技术,也可以作为阴性选择技术。中科博生。 免疫溶解法 当补体存在时,用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵 育,可以使具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理,将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加人细胞悬液或细胞培养物中,使抗体及补体作用于具相应抗原的细胞并溶解之,而对该抗原阴性的细胞进行富集。细胞溶解法适用于细胞悬液或培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。中科博生。 流式细胞分选术 流式细胞仪（flow cytometer,FCM）是一种将流体喷射技术、激光技术、空气技术、射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的仪器。 流式细胞术(fow cytometry）就是应用 FCM检测、分析生物颗粒(包括细胞）的物理和（或）化学特性或借这些特性进行分离纯化的技术。用荧光染料分离细胞的流式细胞仪也称为荧光激活的细胞分选术（fluorescent-activated cell sorting,FACS）。应用流式细胞术分选细胞的依据是不同细胞往往具有不同的表面标志。细胞表面标志的检测常用抗该表面标志的特异性单克隆抗体或多克隆抗体。因此、首先要对待分离目的细胞的特异性表面标志进行荧光染色,而且一般都是免疫荧光染色,即以荧光抗体与细胞表面标志结合,然后用 FCM进行分选。中科博生。 平面黏附分离法 平面黏附分离法（panning)是一种在固相表面进行亲和分离细胞的技术,它利用蛋白质分子可吸附于聚苯乙烯塑料的特性,以其作为亲和剂的不溶性基质,将抗原（或抗体）、配体(或受体)蛋白吸附于其表面,然后与异质性的细胞共孵育,带有相应表面抗原或表面受体（或配体）的细胞将结合于塑料表面,从而将其从异质性细胞悬液中分离出来（阳性筛选）或除去（阴性筛选)。中科博生。 免疫磁珠分选技术 免疫磁性微珠（简称免疫磁珠）是以直径几个微米的磁性微珠作为载体,将抗体或抗原结合在此载体上,即成为带有免疫配基的磁性微珠。磁性微珠是一种人工合成的含金属小颗粒,由3部分组成:核心是金属小颗粒（Fe2O、FesO.）,核心的外层均匀包裹一层高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等）,最外层是功能基团,如氨基(—NH2)、竣基(—COOH)、羟基（—OH）等,以便与生物大分子偶联。这种磁珠要求均匀、球形,并具有超顺磁性及保护性壳。免疫磁珠的大小和形状的均匀性,可使靶物质迅速有效地结合到磁珠上;磁珠的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非特异性结合;超顺磁性可使磁柱置于磁场时显示其磁性,从磁场移出时,磁性消除,磁珠分散;保护性壳可防止金属微粒漏出。中科博生。 免疫磁珠分离技术的基本原理是,磁珠既可结合蛋白质,又可被磁铁所吸附,经过一定处理将抗体（或抗原）结合在磁珠上,使之成为抗体（或抗原）的载体;磁珠上抗体（或抗原)与特异性抗原（或抗体）物质结合后,形成抗原-抗体磁珠免疫复合物;这种复合物在磁力作用下,发生力学移动,使复合物与其他物质分离,从而达到分离特异性抗原(或抗体）的目的（Thomaset al.1999)。磁珠与抗体的结合只与抗体蛋白的通性和磁珠的特性有关,而与不同抗体的个性关系不大,因此磁珠对抗体蛋白的结合具有普遍意义,从而保证其广泛的应用免疫磁珠作用方式有直接和间接两种。直接方式是先用抗体（或抗原）包被磁珠,使之与磁珠结合（物理吸附或化学结合）,再加入待分离物质,其中的抗原（或抗体)将与免疫磁珠结合形成复合物,在磁力作用下,与其他物质分离。中科博生。 间接方式是先用第二抗体(亲和素、抗荧光素的抗体）包被磁珠,当抗原与第一抗体（生物素化抗体、荧光素）结合后,加入包被好的磁珠,即可形成磁珠-第二抗体（亲和素、抗荧光素的抗体）-第一抗体（生物素化抗体、荧光素）-抗原复合物,在磁力作用下,与其他物质分离。与间接方式相比,直接结合方式造成的细胞与基质的非特异性结合较少;但是,直接方式不具有可同时应用多种抗体的习活性。另外,间接方式中采用亲和素-生物素化抗体,旨在利用其高亲和,做交活性:处、他增好默E弈烟的线合活力,从而提高细胞分离的效率交为分离后迅速进行分离效果分析,还可以将荧光素（如FITC）标记在亲和素表运使所分离的细胞在流式细胞仪上马上得到测定分析,省去了免疫荧光染色的时间。中科博生。 免疫磁珠分离技术在临床和基础研究中都有很诱人的应用前景,因为它利国了单克隆抗体的高度特异性而避免了免疫毒素和补体裂解带来的非特异性杀伤作用。与FACS相比,它的另一个优点就是可以处理大量的细胞样品以满足临床移植的需要。 中科博生期待大家一起探讨学习。 |
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