单克隆抗体在抗击新冠病毒中发挥着关键作用,并已被证明能有效减少患者症状由轻症向重症的发展。然而,该领域未来的进展取决于抗体开发的时间和技术。近日,《Nature - Scientific Report》杂志最近发表的一篇文章论证了单B细胞克隆筛选在快速、可靠地识别高亲和力、强效的新冠病毒(SARS-CoV-2)中和抗体方面的应用,并解释了如何增强其中和活性。 中和抗体 该研究中研究的中和抗体属于前者,针对S1蛋白受体结合域(RBD),它可以和SARS-CoV-2的RBD区域结合,阻断该区域与血管紧张素转化酶II受体(ACE2 receptor)的结合,从而达到阻止病毒入侵细胞的功效。该类抗体是人体产生的最多、最主要也是阻断病毒效果最好的一类抗体。 图1. SARS-CoV-2刺突(S)的蛋白结构。a. SARS-CoV-2病毒粒子及其S蛋白示意图。 E包膜,M膜,N核衣壳,血管紧张素转换酶2。 b. SARS-CoV-2 S蛋白三聚体(PDB 6VXX)低温em结构。分别用橙色、绿色和蓝色三种颜色来表示这三个亚基。 c. SARS-CoV-2 S受体结合域(RBD)和S1亚基n端结构域(NTD)。 d. SARS-CoV-2 RBD与人ACE2复合物的晶体结构(PDB 6M0J)。人类ACE2是浅蓝色的 通过单B细胞的筛选,可以更快的发现抗体 图2. 从单个B细胞中分离发现有效的SARS-CoV-2中和抗体并进行鉴定的方法综述 该方法的优点是使用了经过体细胞高突变的原生抗体序列,并保留了原生VH/VL配对。此外,发现过程是高通量的,可以进一步对高免疫抗体库进行评估。 针对SARS-CoV-2病毒的中和抗体 接着对BALB/c小鼠进行免疫后,通过单细胞分选从脾脏材料中分离anti‑RBD IgG1+B细胞,并处理VH /VL基因。将得到的VH/VL基因对克隆到哺乳动物表达质粒(含人IgG1恒定区和用于嵌合抗体表达的kappa轻链区)中,瞬时转染到HEK 293-6E细胞中。 抗体鉴定包括Protein A磁珠的纯化、抗原结合能力、中和活性等性能的评估。 亲和性分析 该方法使用了结合抗原沉淀法进行亲和力的分析,将链霉亲和素-磁珠与包被有生物素化RBD一起孵育后,洗涤去除掉未结合的抗体。接着使用Alexa Fluor®647荧光二抗(山羊来源,抗人IgG,Fc片段特异性亲和纯化二抗,Jackson ImmunoResearch)进行孵育并通过流式细胞术进行分析。结果显示,两个克隆体(12H2和13I1)对RBD具有较低的pM EC50值,其值与先前报道的一种有效中和抗体CB6相当(图3)。 图3. 分离出的抗体与SARS-CoV-2受体结合区域具有高度亲和力。 特异性分析 同时,研究人员评估了包被13I1抗体的磁珠与野生型SARS-CoV-2 S1蛋白以及两种变体(B.1.1.7和B.1.351)的S1蛋白结合情况。具体实验方法是将珠子与SARS-CoV-2 S1蛋白孵育,然后添加鸡属来源的抗his标签抗体,并使用Alexa Fluor®647 荧光二抗(驴来源,抗鸡IgY,F(ab’)₂片段亲和纯化二抗,Jackson ImmunoResearch),接着进行流式细胞检测。 数据显示,13I1与B.1.1.7的结合保留了下来,但与B.1.351的结合基本消失,说明B.1.351这种变体的蛋白可能通过某种机制逃脱了SARS-CoV-2抗体的结合(图4)。 图4. 13I1抗体与SARS-CoV-2 S1亚基变异的亲和性分析 研究还显示,中和抗体具有较高的特异性和稳定性。如图5A所示,未特异性结合的抗体通过与CHO细胞中生物素化的可溶性膜蛋白孵育进行分析,并通过流式分析法来检测。两种抗体:高非特异性结合(emibetuzumab)和低非特异性结合(elotuzumab),作为对照抗体。两种对照抗体与实际药物并不完全相同,因为它们具有实际药物的可变区域和共同的IgG1框架。
中和活性 通过技术手段提高中和活性 总结 |
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