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GS FLX 测序原理 GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
图1：GS FLX 高通量测序方法原理示意图 GS FLX系统的工作流程 GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。 1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。 2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。变性处理回收单链的DNA（sstDNA），具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。 3）一个DNA片段＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 4）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。
5）一个磁珠＝一条读长：携带DNA的捕获磁珠随后放入“Pico TiterPlate”（PTP）板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD相机捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。 6）数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。 GS FLX系统的准确率在99%以上。其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生误差。因此，454测序平台的主要错误类型是插入-缺失，而不是替换。 |
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