结直肠癌分子分型研究进展

陈泽洋 汪欣 吴涛 刘玉村 王鹏远 

中华肿瘤杂志, 2017,39(9) : 641-645.

在世界范围内，结直肠癌在男性和女性恶性肿瘤的发病率中，分别位居第三和第二位^[1]，严重危害人类健康。结直肠癌在定性诊断之后，分期和分型是确立治疗方案、评估预后的主要依据。但是在临床实践中常常遇到同一TNM分期的患者，对同一治疗方案的反应不同，预后也有差异，有时差异度非常悬殊^[2]。因此，探索更完善、更有效的结直肠癌分期和分型指标是临床研究的重点。随着肿瘤分子生物学研究的飞速发展，一系列与肿瘤遗传学、表观遗传学、代谢学相关的遗传标记、信号通路、分子及多分子组合形成的新分类工具不断涌现，通过验证发现其对指导临床治疗、预测疾病转归有积极的意义。本研究中，我们将重点阐述结直肠癌分子分型与预后及治疗的关系，并与传统的分期方法和病理分型方法进行比较，以期能够指导临床。

一、结直肠癌的传统分期

1．Duke′s分期：

结直肠癌的Duke′s分期是根据肿瘤浸润肠壁的深浅程度及有无淋巴结转移，分为A、B、C和D 4期。A期：肿瘤限于黏膜层；B1期：肿瘤侵及肌层，但未穿透，无淋巴结转移；B2期：肿瘤穿透肌层，但无淋巴结转移；C1期：肿瘤未穿透肌层，但有淋巴结转移；C2期：肿瘤穿透肠壁，并有淋巴结转移；D期：有远隔脏器转移。通过对不同结直肠癌患者进行Duke′s分期，可对其预后进行预测。Marie等[3]认为，结直肠癌患者的预后与其分期密切相关，分期越晚，则其术后复发率越高。

2．TNM分期：

传统的TNM病理分期将结直肠癌患者分为Ⅰ～Ⅳ期。Ⅰ期：肿瘤局限于肠壁固有肌层；Ⅱ期：肿瘤突破固有肌层，达到浆膜下(ⅡA)及浆膜外(ⅡB、ⅡC)；Ⅲ期：出现淋巴结转移者，根据淋巴结部位及淋巴结转移数，分为ⅢA、ⅢB和ⅢC期；Ⅳ期：远处转移，如肝、肺等器官。根据不同的TNM分期，可对结直肠癌患者的预后进行预测，同时指导其治疗。按照美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第7版TNM分期标准，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期结直肠癌患者的5年生存率分别为90.1%、72.6%、53.8%和10.4%。AJCC肿瘤分期第6版对Ⅲ期结直肠癌的分期标准进行了细化，将其分为ⅢA、ⅢB和ⅢC期。Greene等[4]的研究结果显示，ⅢA、ⅢB和ⅢC期结直肠癌患者的5年生存率分别为59.8%、42.0%和27.3%，差异有统计学意义(P<0.01)，这项结论为结直肠癌患者制订辅助治疗方案提供了重要参考。

二、结直肠癌的病理组织学分型

1．组织类型分型：

以病理组织学检查为依据，结直肠癌可分为腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌和神经内分泌肿瘤等。其中黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌的恶性程度高。有研究显示，分化较差的黏液腺癌和印戒细胞癌则更多见于青年人，随着患者年龄的增长，其在人群中所占的比例逐渐下降[5,6]。黏液腺癌和印戒细胞癌是结直肠癌患者独立的预后危险因素，患者确诊时往往TNM分期较晚[7]。因此，对病情进展快的结直肠黏液腺癌和印戒细胞癌，应尽早接受手术治疗，根治性手术能改善患者预后，提高患者的5年生存率。

2．组织学起源分型：

传统观念认为，增生性息肉不同于腺瘤，不属于结直肠癌的癌前病变[8]。然而相关研究结果显示，同时具有增生性息肉的锯齿状结构和传统腺瘤异型性上皮特征的锯齿状息肉仍有一定的恶性潜能[9,10]。因此，结直肠癌可能具有不同的组织学起源，如腺瘤癌变途径、'denove癌'途径(不经过特定的良性病变或癌前病变，直接从正常黏膜发生)、锯齿状息肉癌变途径。锯齿状息肉的主要类型包括增生性息肉、传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma，TSA)和无蒂锯齿状腺瘤(sessile serrated adenoma，SSA)[11,12]。锯齿状息肉癌变途径的常见分子学变化包括BRAF基因突变和KRAS基因突变[12]。高水平的CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype，CIMP-high)为BRAF突变锯齿状息肉的特征[13]。大部分锯齿状息肉都具有特征性的锯齿状结构[9]，其形态学特征为这种癌前病变提供了重要的诊断依据[14]。

三、结直肠癌分子分型方法及其与预后和治疗的关系

1．基因组不稳定性分型：

结直肠癌的发生是一个多阶段的进展过程，其基本的分子变化为基因组的不稳定性。导致结直肠癌患者基因组不稳定的主要通路包括：(1)微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)通路：高微卫星不稳定性(microsatellite instability high，MSI-H)、低微卫星不稳定性(microsatellite instability low, MSI-L)、微卫星稳定(microsatellite stable, MSS)。(2)CIMP通路：高CIMP(CIMP-high)、低CIMP(CIMP-low)、CIMP阴性(CIMP-neg)。据此，Jass等[15]将结直肠癌分为5种亚型：(1)CIMP-high/MSI-H/BRAF突变型；(2)CIMP-high/MSI-L或MSS/BRAF突变型；(3)CIMP-low/MSS型或MSI-L/KRAS突变性；(4)CIMP-neg/MSS型；(5)CIMP-neg/MSI-H型，又称Lynch综合征。

基于基因表达水平对结直肠癌进行分子分型不仅加深了人们对结直肠癌发病机制的理解，同时也将对结直肠癌患者的个体化预防和治疗策略的选择产生深远影响。有研究显示，各期结直肠患者均可出现MSI，其中Ⅱ期患者占22%，Ⅲ期患者占12%，Ⅳ期患者占2%[16]。有研究结果显示，MSI-H患者的预后优于MSS患者[17]。但Ribic等[18]的研究结果表明，MSI-H患者不能从以氟尿嘧啶(5-Fu)单药为基础的辅助化疗中获益。MSI或许可以作为结直肠癌患者预后的预测因子，影响患者治疗策略的选择。Benson等[19]利用MSI和18号染色体长臂缺失情况对Ⅱ期结直肠癌患者接受辅助治疗后的复发风险进行分级，结果显示，低风险组患者可以继续观察病情变化，而高风险组患者需要接受FOLFOX方案(奥沙利铂＋亚叶酸钙＋5-Fu)和贝伐珠单抗的辅助治疗。

2．基因模块分型：

Budinska等[20]根据1 113个基因的表达特征，将结直肠癌的基因分成54个基因模块，进而将结直肠癌分为5种主要的亚型：表面隐窝样(A型)、下隐窝样(B型)、高CIMP样(C型)、间质型(D型)和混合型(E型)。A型和B型的预后较好，C型和D型的预后较差，C型特征为MSI和BRAF突变，D型特征为BRAF高突变。有研究显示，BRAF突变在转移性结直肠癌中提示预后不良，但其不影响西妥昔单抗的作用效果[21]。许多发生于BRAF突变的结直肠癌患者对高选择性的BRAF抑制剂维罗非尼敏感[22]。

3．非监测聚类分型：

De Sousa等[23]采用非监测聚类的方法，发现了3种结直肠癌亚型(colon cancer subtypes，CCS)：(1)CCS1：特点为染色体不稳定(chromosome instability，CIN)；(2)CCS2：特点为MSI；(3)CCS3：特点为MSS，且CIMP-high。其中CCS3型预后差，高表达基质重塑和上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)相关基因，其对抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向治疗不敏感。

4．结肠隐窝细胞分型：

Sadanandam等[24]通过分析1 290例结直肠癌患者的基因表达，将结直肠癌分为5个亚型：(1)杯状细胞型：表现为杯状细胞特异性基因(MUC2/TFF3)高表达；(2)肠黏膜细胞型：肠黏膜细胞相关基因高表达；(3)干细胞型：WNT信号通路基因、干细胞相关基因、肌上皮和间质相关基因高表达，分化相关基因低表达；(4)炎症型：趋化因子和干扰素相关基因高表达；(5)移行扩增型：不同程度的干细胞和WNT相关基因表达。每种亚型均用不同的结肠隐窝细胞来定义，不同亚型均有不同程度的'干细胞化'和WNT相关基因的表达。杯状细胞型和移行扩增型患者的预后好，提示术后无需化疗；而干细胞型和炎症型患者的预后差，但对FOLFOX方案敏感。

5．交互式非负矩阵分解(iterative non-negative matrix factorization，iNMF)分型：

Schlicker等[25]通过运用iNMF的方式，经过两个步骤，将结直肠癌分为5个亚型。首先将结直肠癌患者分为间质型(1型)和上皮型(2型)。然后将间质型(1型)分为3个亚型：1.1型：MAPK、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)基因和钙信号表达活跃；1.2型：免疫系统相关通路基因表达活跃；1.3型：转运体基因表达活跃。将上皮型(2型)分为2个亚型：2.1型：免疫系统相关通路基因表达活跃；2.2型：染色体13q和20q上的基因高表达。上皮型(2型)高表达极光激酶A，因此，极光激酶抑制剂有望成为上皮型结直肠癌的特异性靶向治疗药物。

6．肿瘤生物学标志分型：

Roepman等[26]通过分析188例Ⅰ～Ⅳ期结直肠癌患者的全基因组序列，基于EMT、DNA错配修复基因缺陷(deficient DNA mismatch repair，dMMR)和细胞增殖3个典型的肿瘤生物学标志，将结直肠癌分为3种亚型(A型、B型和C型)，并在543例Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌患者中得到验证。A型：占22%，BRAF突变频发以及dMMR；B型：占62%，总的基因突变频率低；C型：占16%，高表达EMT相关基因，不能从辅助化疗中获益。肿瘤生物学标志分型与结直肠癌患者的预后和化疗效果关系密切。其中A型患者的预后最好，B型居中，C型最差。在Ⅲ期结直肠癌患者中，A型和B型患者能从5-Fu化疗中获益，而C型患者却不能从辅助化疗中获益。

7．生物学特点分型：

Marisa等[27]分析了443例结肠癌患者的基因表达数据，并依据基因表达的不同将结肠癌患者分为6个亚型。C1型：免疫系统相关通路基因低表达；C2型：DNA的MMR基因缺乏；C3型：KRAS基因高表达；C4型：肿瘤干细胞相关基因高表达；C5型：WNT信号通路相关基因高表达；C6型：CIN阳性，但生物学特点上与C1和C5型明显不同。其中C4和C6型患者的预后较差，C2型常表现为dMMR。有研究结果显示，对dMMR患者使用程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)特异性抑制剂派姆单抗(pembrolizumab)能改善结直肠癌患者的预后[28]。Pogue-Geile等[29]对接受mFOLFOX6方案或mFOLFOX6＋贝伐珠单抗方案化疗的2 710例Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者进行了12个月的随访，结果显示，dMMR患者能明显从贝伐珠单抗的靶向治疗中获益(HR＝0.52，95% CI为0.29～0.94，P＝0.02)。C3型常表现为KRAS基因高频突变。Deng等[30]的研究结果显示，KRAS基因突变提示预后不良，但发生KRAS突变的Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌患者能从FOLFOX化疗方案中获益。

以上7种分型方法或者属于单中心研究，或者病例数有限，且各分型方法在亚型数量和释义方面也并不一致，因此均未得到广泛认可和接受。目前，研究者们也逐渐认识到因肿瘤生物学行为的复杂性，用单一标志物或者少数几个分子标志物进行分子分型存在很大的局限性，因此，研究者们转而寻求大数据的思路，采用集成网络化分析模式，希望提出一种更加精准、统一的结直肠癌分子分型的方法。

8．共识分子亚型(consensus molecular subtype，CMS)分型：

2012—2014年，相继出现了6个相互独立、基于基因型的结直肠癌亚型分类系统[20,23,24,25,26,27]。6个分类系统间有共性，但是，相互之间在亚型数量和释义方面的不一致也显而易见。研究者们将纳入分型的4 151例结直肠癌患者的肿瘤基因组信息，采用集成网络化分析模式，将上述具有关联性的6个独立分类系统合并为4个各具特征的CMS：(1)CMS1型：MSI为特点的免疫活化型，占14%，表现为高突变性，MSI及免疫高度活化；(2)CMS2型：经典型，占37%，表现为上皮细胞分化，WNT和MYC信号通路明显激活；(3)CMS3型：代谢型，占13%，表现为上皮细胞分化，明显的代谢失调；(4)CMS4型：间质型，占23%，表现为TGF-β明显激活、间质浸润和血管生成活跃。

CMS分型与患者的预后存在相关性。CMS1型患者复发后的生存率很低；CMS2型患者复发后的生存率高；而CMS4型患者的总生存率和无复发生存率更低，确诊时的肿瘤分期相对较晚(对应TNM分期中的Ⅲ期和Ⅳ期)[31]。

目前，CMS分型是最具说服力的结直肠癌分类系统，具有清楚的生物学判读性，可能成为未来临床分层和基于分型的靶向治疗的基础。

四、结直肠癌分子分型方法的研究前景

随着靶向治疗在结直肠癌综合治疗中作用的日益突显，分子分型指导治疗的概念已经逐渐深入人心。但Prasad[32]认为，仅有1.5%的恶性肿瘤复发患者和难治性实体瘤患者能从肿瘤的个体化治疗中获益，而靶向治疗给大部分患者带来的却是药物的副作用和昂贵的治疗费用。Tannock等[33]认为，由于多数靶向治疗药物仅能部分阻断细胞增生途径，且存在肿瘤异质性、药物副作用等原因，目前精准医疗的开展仍不够理想。即便如此，临床医师们仍迫切需要能够精确指导治疗方案的分子分型方法。我们在临床实践中，开展了大量包括全盆腔脏器切除术在内的联合脏器广泛切除手术，积累了丰富的经验。我们也观察到，部分结直肠癌患者二次手术R0切除后，能获得长期生存，而有些具有类似临床特征的患者预后却很差，短期内可发生远处转移[34]。因此，期待结直肠癌分子分型的研究进展，能更好地预测病情转归，指导临床中合适的患者进行手术治疗。

目前，结直肠癌的诊治已经跨入分子诊断和治疗的时代。基于基因表达图谱将肿瘤分为具有不同基因组特征的亚型，不仅加深了对结直肠癌发病机制的理解，还能对患者的复发风险及预后进行精准的预测，为靶向治疗提供相关靶点，这对于改善结直肠癌患者的预后意义重大。然而受制于靶向药物有限的疗效、药物副作用、昂贵的治疗费用以及肿瘤异质性等多方面的因素，在临床工作中，结直肠癌的个体化治疗并未得到广泛的开展。因此，我们可先进行一些小样本量且经过精心设计的合作研究来验证相关靶向药物的疗效，并尝试克服其局限性。