基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料及制备方法（专利）

一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料及制备方法 【专利摘要】本发明公开了一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料及制备方法，它由一定比例的胶原蛋白、硝酸钙、磷酸氢二铵组成，其步骤：A、鱼皮胶原蛋白的提取；B、胶原蛋白和羟基磷灰石的原位复合；C、胶原蛋白生物复合材料的交联。得到的胶原蛋白生物复合材料具有良好的生物相容性，配方合理，操作方便，减轻了环境污染。方法易行，操作简便，采用安全的胶原蛋白提取方法，并通过合适的胶原蛋白和硝酸钙、磷酸氢二铵的配比合成复合材料，具有一定的力学性能和良好的生物相容性。可以为成骨细胞的生长提供适宜的生长环境，是潜在的临床骨材料的替代品。 【专利说明】一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料及制备方法 【技术领域】 [0001]本发明涉及一种生物复合材料，更具体涉及一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，同时还涉及一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，属于生物医学材料领域。本发明将羟基磷灰石包埋于胶原蛋白基质中，合成的胶原蛋白复合生物材料具有生物可降解性高、表面能大、生物活性好、相容性良好的优点，是潜在的天然骨修复材料，可应用于骨组织工程，作为临床骨材料替代品。 【背景技术】 [0002]胶原蛋白具有其独特的天然三螺旋结构和性质，而胶原纤维是动物皮肤组织的主要纤维，由于具有特殊的立体网状结构，使得其具有广泛的用途。胶原蛋白是构成动物体的重要蛋白质，广泛分布于动物体的器官中，并在器官正常的生理活动中发挥着重要作用，因此胶原蛋白结构的改变会导致很多疾病的发生。胶原蛋白作为天然材料，具有良好的生物相容性、低抗原性、引导细胞再生、低毒性、易降解性等优点，能够广泛应用于生物医学材料中。 [0003]天然骨是由无机成分羟基磷灰石和胶原蛋白、糖蛋白、糖胺聚糖等少量有机成分组成，无机成分与有机成分的含量比约为7: 3，其中胶原蛋白占有机成分的90%。I型胶原蛋白是使骨骼具有韧性和弹性的主要结构成分，同时也是骨盐的栖息场所。I型胶原蛋白的代谢情况同骨代谢密切相关，当胶原蛋白代谢发生异常时，通常也会导致骨组织的病变。在口腔科、骨科、整形外科中，由于各种原因导致的骨缺损很多，于是临床治疗中则急需良好骨材料进行骨缺损的修复重建。目前骨材料的来源多为同种异体移植和自体移植，由于自体移植的来源材料的限制，异体移植又可能会导致机体的排异反应。因此人们开始研究通过体外合成生物复合材料来用于骨缺损替代。 [0004]现有研究中，多数用于骨替代的材料为羟基磷灰石和聚合物的机械混合物，由于只是简单的物理混合，各相之间不能很好的融合，其结构很难与天然骨相似。天然骨中，羟基磷灰石同胶原纤维紧密结合形成致密的结构，羟基磷灰石的晶体一般为小于10nm。 [0005]因此本发明中，将羟基磷灰石包埋于胶原蛋白基质中，合成的胶原蛋白复合生物材料具有生物可降解性高、表面能大、生物活性好、相容性良好的优点，是潜在的天然骨修复材料，可应用于骨组织工程。 【发明内容】  [0006]本发明的目的是在于提供了一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，配方合理，操作方便，该方法的到的胶原蛋白具有来源安全性，同时得到的复合材料具有良好的生物相容性。将水产品加工过程中下脚料的鱼皮进行进一步的加工成生物复合材料作为临床骨材料的替代品在带来巨大的经济效益，也减轻了环境污染。 [0007]本发明的另一个目的是在于提供了一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，方法易行，操作简便，该方法采用安全的胶原蛋白提取方法，并通过合适的胶原蛋白和硝酸钙、磷酸氢二铵的配比合成复合材料，具有一定的力学性能和良好的生物相容性。 [0008]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施: 其构思是:将鱼皮进行除去脂肪、杂蛋白的前处理，进一步溶解鱼皮经过纯化制得I型胶原蛋白。将胶原蛋白和硝酸钙、磷酸氢二铵通过原位合成，通过冷冻干燥得到的生物复合材料。 [0009]一种基于鱼 皮胶原蛋白的生物复合材料，它由下列原料重量份的制成: 原料重量份 胶原蛋白20-30 硝酸钙58.80-137.20 磷酸氢二铵19.73-46.04。 [0010]一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，它由下列原料重量份的制成(优选范围): 原料重量份 胶原蛋白22-28 硝酸钙68-118 磷酸氢二铵22-43。 [0011]一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，它由下列原料重量份的制成(较好范围): 原料重量份 胶原蛋白24-26 硝酸钙78-90 磷酸氢二铵32-38。 [0012]一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，它由下列原料重量份的制成(最佳值): 原料重量份 胶原蛋白0.25 硝酸钙1.37 磷酸氢二铵0.46。 [0013]一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，其步骤是: A、将鱼皮进行处理，除去鱼皮中的脂肪和杂蛋白；本发明所使用的鱼皮为斑点叉尾鮰鱼皮和大口鲶鱼皮。 [0014]B、将鱼皮和0.5mol/L的乙酸按照W/V=l: 40的比例，4°C低速搅拌22 — 26h。22 —26h后，4 °C下在5000r/min离心9 一 I Imin，取上清，将未提取彻底的鱼皮再次用等量的0.5mol/L的乙酸进行提取； C、将步骤B中提取得到的胶原蛋白溶液中加入一定量5mol/L的氯化钠乙酸(0.5mol/L)溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L，静置过夜，离心弃上清。再将沉淀溶于0.5 mol/L乙酸，8000 r/min离心除去不溶性杂质。将离心得到的沉淀再次加入0.5 mol/L乙酸,3 —5次盐析，溶解除去杂质。最后将沉淀溶解于50倍体积的0.1%乙酸溶液中，进行透析，直至用AgNO3检测不到Cf为止，再对透析过的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥，得到纯化的胶原蛋白。[0015]D、将步骤C中得到的胶原蛋白，同0.5%质量比乙酸配制成胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液同lmol/L硝酸钙和磷酸氢二铵按比例混合，通过原位合成的方法(林晓艳，鲁建，李虎，张兴栋.纳米羟基磷灰石/胶原复合材料制备方法比较研究.化学研究与应用，2005，5:611- 614)，制得胶原蛋白生物复合材料。 [0016]E、将步骤D中制得的胶原蛋白复合材料，同0.25%质量比戊二醛进行交联，反应温度为35 - 39°C，反应时间为22 - 26h。 [0017]F、将交联后的复合材料用超纯水反复清洗2 — 4次，除去残留的交联剂和未反应完全的硝酸钙和磷酸氢二铵。 [0018]G、将步骤F中的复合材_70°C冰箱预冻后置于冷冻干燥机内36_60h后取出，封装，辐照灭菌(用6tlCo作为射线辐照源，辐照剂量为25 kGy),即可得到具有一定力学性能的复合材料，鱼皮胶原蛋白生物复合材料。 [0019]所述步骤A中的前处理:在4°CT,以料液比1:10(W/V)加入0.lmol/L的NaOH搅拌5h，冰水冲洗鱼皮至中性。加入10%正丁醇(W/V=l:30)，静置22 — 26h，冰水冲洗鱼皮 至中性。 [0020]作为优化，步骤B中试剂分别为0.5mol/L的乙酸， 作为优化，向步骤B提取得到的胶原蛋白溶液中加入一定量5mol/L的氯化钠乙酸(0.5mol/L)溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L，静置过夜，5000-10000 r/min离心10-20min,取沉淀,将所得沉淀用`0.5mol/L的乙酸溶解,反复盐析4次。再将得到的沉淀溶解于1%质量比的乙酸溶液中，用蒸馏水透析4-7d。每天更换蒸馏水3-4次，将透析液进行冷冻干燥即得到纯化胶原蛋白。 [0021]作为优化，步骤D中加入一定量的lmol/L硝酸钙和磷酸氢二铵溶液，使胶原蛋白同原位合成的羟基磷灰石的质量分别比为50:50、30:70。 [0022]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果: (I)本胶原蛋白复合材料的胶原蛋白为I型胶原蛋白，作为细胞外基质的重要成分，可以为成骨细胞提供良好的营养环境，对成骨细胞的成骨有良好的促进作用，同时也为骨组织钙化提供了必不可少的结构。 [0023](2)将鱼类加工过程中产生的下脚料中的鱼皮进行胶原蛋白的提取，并加工成为生物复合材料，不仅提高了鱼皮的附加价值，同时对减少环境污染、充分利用渔业资源、对提高经济效益具有重要作用。 [0024](3)通过交联制备的胶原蛋白生物复合材料具有良好的结构完整性和较好的力学性能。 [0025](4)在将胶原蛋白复合材料置于模具冷冻干燥的过程中，可以根据不同骨受损的修复要求，加工成不同规格和形状，以此可以满足多种应用需求，可以为成骨细胞的生长提供适宜的生长环境，是潜在的临床骨材料的替代品。 [0026]【专利附图】  【附图说明】 图1 A为一种基于鱼皮胶原蛋白复合材料的外观示意图。 [0027]图1 B为一种基于鱼皮胶原蛋白复合材料的外观示意图。 [0028]通过原位合成的方法得到的基于鱼皮胶原蛋白复合材料为白色柱状，具有良好的孔隙率，且形状规则。[0029]图2为一种基于鱼皮胶原蛋白复合材料扫描电镜图。 [0030]其中A为酸溶性胶原蛋白含量为50%复合材料SEM形貌图，B为酸溶性胶原蛋白含量为30%复合材料SEM形貌图。 [0031]图3为一种细胞在复合材料浸提液中的体外培养结果(第7天)示意图。其中A为为成骨细胞在空白培养基中体外培养7天激光共聚焦显微图，B为成骨细胞在酸溶性胶原蛋白含量为50%复合材料浸提液中体外培养7天激光共聚焦显微图，C为成骨细胞在酸溶性胶原蛋白含量为30%复合材料浸提液中体外培养7天激光共聚焦显微图。 【具体实施方式】 [0032]下面结合具体实施例，对本发明的一种基于鱼皮胶原蛋白生物复合材料及其制备方法做进一步说明。需要说明的是本发明的保护范围不受限于实施例所述的范围。 [0033]实施例1: 一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，它由下列原料重量份的制成: 原料重量份 胶原蛋白25 硝酸钙58.80 磷酸氢二铵19.73 一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，其步骤是: a、将鱼皮进行处理，除去鱼皮中的脂肪和杂蛋白； b、将鱼皮和0.5mol/L的乙酸按照ff/V=l:40的比例，4°C低速搅拌22或23或24或25或26h。22或23或24或25或26h后，4°C下在5000r/min离心9或10或llmin，取上清，将未提取彻底的鱼皮再次用等量的试剂进行提取； C、将步骤b中提取得到的胶原蛋白溶液中加入一定量5mol/L的氯化钠乙酸(0.5mol/U溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L,静置过夜，5000-10000r/min离心10_20min，取沉淀，将所得沉淀用0.5mol/L的乙酸溶解，反复盐析4次。再将得到的沉淀溶解于1%质量比的乙酸溶液中，用蒸馏水透析4-7d。每天更换蒸馏水3-4次，将透析过的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥即得到纯化胶原蛋白。 [0034]d、将步骤c中得到的胶原蛋白，同0.5%质量比乙酸配制成胶原蛋白溶液。将胶原蛋白溶液同lmol/L硝酸钙和磷酸氢二铵按比例混合，通过原位合成的方法，制得胶原蛋白生物复合材料。 [0035]e、将步骤d中制得的胶原蛋白复合材料，同0.25%质量比戊二醛进行交联，反应温度为35或36或37或38或39°C，反应时间为22或23或24或25或26h。 [0036]f、将交联后的复合材料用超纯水反复清洗2或3或4次，除去残留的交联剂和未反应完全的硝酸钙和磷酸氢二铵。 [0037]g、将步骤f中的复合材_70°C冰箱预冻后置于冷冻干燥机内36_60h后取出，封装，辐照灭菌(用6tlCo作为射线辐照源，辐照剂量为25 kGy)，即可得到具有一定力学性能的复合材料，鱼皮胶原蛋白生物复合材料。 [0038]所述步骤a中的前处理:在4 °CT,以料液比1:10(W/V)加入0.lmol/L的NaOH搅拌5h，冰水冲洗鱼皮至中性。加入10%正丁醇(W/V=l:30)，静置22 — 26h，冰水冲洗鱼皮至中性。 [0039]作为优化，向步骤b中提取得到的胶原蛋白溶液中加入NaCl，至最终盐浓度为 0.9mol/L。盐析过夜,5000-10000r/min,离心10_20min,取沉淀,将所得沉淀用0.5mol/L的乙酸溶解，反复盐析4次。再将得到的沉淀溶解于1%质量比的乙酸溶液中，用蒸馏水透析4-7d。每天更换蒸馏水3-4次，将透析过的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥即得到纯化胶原蛋白。 [0040]作为优化，步骤d中加入一定量的lmol/L硝酸钙和磷酸氢二铵溶液，使胶原蛋白同原位合成的羟基磷灰石的质量分别比为50:50、40:60、30:70。 [0041]一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，它由下列原料重量份的制成: 【权利要求】 1.一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，它由下列原料重量份的制成:原料重量份 胶原蛋白20-30 硝酸钙58.80-137.20 磷酸氢二铵19.73-46.04。 2.根据权利要求1所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，其特征在于:原料重量份 胶原蛋白22-28 硝酸钙68-118 磷酸氢二铵22-43。 3.根据权利要求1所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，其特征在于:原料重量份 胶原蛋白24-26 硝酸钙78-90 磷酸氢二铵32-38。 4.根据权利要求1所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，其特征在于:原料重量份 胶原蛋白0.25 硝酸钙1.37 根据权利要求1所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料，其特征在于:原料重量份胶原蛋白25 硝酸钙58.80 磷酸氢二铵19.73。 5.权利要求1所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，其步骤是: 将鱼皮进行处理，除去鱼皮中的脂肪和杂蛋白；所述的鱼皮为斑点叉尾鮰鱼皮和大口鲶鱼皮； 将鱼皮和0.5mol/L的乙酸按照ff/V=l: 40的比例，4°C搅拌22 — 26h，22 — 26h后，4°C下在5000r/min离心9 一 Ilmin,取上清,将未提取的鱼皮再次用等量的0.5mol/L的乙酸进行提取； 将步骤b中提取得到的胶原蛋白溶液中加入5mol/L的氯化钠乙酸(0.5mol/L)溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L,静置过夜，离心弃上清，再将沉淀溶于0.5 mo I/L乙酸，8000r/min离心除去不溶性杂质,将离心得到的沉淀再次加入0.5 mol/L乙酸,3 — 5次盐析,溶解除去杂质，最后将沉淀溶解于50倍体积的0.1%乙酸溶液中，进行透析，直至用AgNO3检测不到Cl—为止，再对透析过的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥，得到纯化的胶原蛋白； 将步骤c中得到的胶原蛋白，同0.5%质量比乙酸配制成胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液同lmol/L硝酸钙和磷酸氢二铵按比例混合，通过原位合成的方法，制得胶原蛋白生物复合材料； 将步骤d中制得的胶原蛋白复合材料，同0.25%质量比戊二醛进行交联，反应温度为·35 - 39°C，反应时间为22 - 26h ； 将交联后的复合材料用超纯水反复清洗2 — 4次，除去残留的交联剂和未反应的硝酸钙和磷酸氢二铵； 将步骤f中的复合材_70°C冰箱预冻后置于冷冻干燥机内36-60h后取出，封装，辐照灭菌，得到复合材料，鱼皮胶原蛋白生物复合材料。 6.根据权利要求6所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，所述的步骤a中的前处理:在4°C下，以料液比1:10W/V加入0.lmol/L的NaOH搅拌5h，冰水冲洗鱼皮至中性，加入10%正丁醇W/V=l:30，静置22 - 26h，冰水冲洗鱼皮至中性。 7.根据权利要求1所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，所述的步骤b提取得到的胶原蛋白溶液中加入5mol/L的氯化钠乙酸溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L,静置过夜，5000-10000r/min离心10_20min，取沉淀，将所得沉淀用0.5mol/L的乙酸溶解，反复盐析4次，再将得到的沉淀溶解于0.1%质量比的乙酸溶液中，用蒸馏水透析4-7d，每天更换蒸馏水3-4次，将透析过的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥即得到纯化胶原蛋白。 8.根据权利要求1所述的一种基于鱼皮胶原蛋白的生物复合材料的制备方法，所述的步骤d中加入lmol/L硝酸钙和磷酸氢二铵溶液，使胶原蛋白同原位合成的羟基磷灰石的质量分别比为50:50、40:60、30:70。 【文档编号】A61L27/02GK103690996SQ201310733757 【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日 【发明者】喻亚丽, 周运涛, 何力, 甘金华, 吕磊, 庞昆 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所。