基于同一激发光下实现两种不同发光的比值荧光分析方法在分析领域显示出极大的优越性，引起了广泛的研究兴趣。它可以提供内置自校准，提高信噪比和更可靠的定量分析用于校正许多与分析无关的因素，尤其是在实际的生物成像中。近年来，大多数报道的比值传感器都是通过将两种独立的光源组合或共轭而成，很少有报道直接合成具有双发射荧光性质的纳米探针。此外，目前报道的比率传感方案大多基于荧光猝灭，在实际应用中容易受到外部猝灭剂或其他环境因素的各种干扰。荧光增强检测方法是非常理想的，因为它是在黑暗的背景下增强荧光信号，所以其灵敏度更高。且这种检测方法的选择性也更高，可以排除许多诱导猝灭因素的干扰。 荧光金纳米团簇（Gold nanoclusters, Au NCs）作为一种新兴的纳米材料，在生物传感、成像和光电显示等领域已成为许多传统荧光材料的替代品。在过去的几十年里，人们也致力于调节它们的荧光性质，包括增强发射强度和调节发射颜色。然而，几乎所有这些报道的研究都是关于单发射波长的Au NCs。没有额外结合或装配，直接合成本征双发射Au NCs的报道很少，这可能与具有两个发射波长的Au NCs的发射机制不清楚有关。因此，制备本征双发射金纳米团簇探针具有重要意义，且阐明合成过程中影响双发射金纳米团簇发射性能的关键因素也是一个很吸引人的研究方向。 基于此，合肥工业大学刘洪林教授课题组报道了一种新型的单波长激发双发射金纳米团簇(d-AuNCs)，它具有420 nm和630 nm两种不同的荧光发射。该金簇的双阶段形成机制证明其对活细胞中的缬氨酸和三价铬离子(Cr3+)具有完全不同的光谱比率模式的敏感响应，且具有高的对比度，很好地避免了信号的波动。相关研究成果近期以题为“Surface motif sensitivity of dual emissive gold nanoclusters for robust ratiometric intracellular imaging”发表在Chemical Communication上（DOI: 10.1039/D0CC03036H）。 图1. 双发射金簇的发光机制。(a)两阶段形成过程和(b)缬氨酸和Cr3+的比值检测。 作者首先通过氯金酸（HAuCl4）和谷胱甘肽（GSH）在140ºC下反应制备得到单发射金纳米团簇（s-Au NCs），然后在碱性条件下，添加11-巯基十一酸（11-MUA）原位反应形成d-Au NCs。相比原来的s-Au NCs（610 nm处荧光峰），d-Au NCs在420 nm和630 nm处有两个不同的荧光峰。作者研究发现合成双发射金簇的第一阶段是基团快速交换的过程，新的420 nm的荧光峰归因于Au(I)-11-MUA单元向Au(0)核的配体-金属电荷转移。而合成的第二阶段是一个缓慢的表面基元优化和重构过程，新的630 nm的荧光峰归因于Au(I)-GSH单元向Au(0)核的配体-金属电荷转移。作者通过混合s-Au NCs和11-MUA-AuNCs进行对比，发现并不会出现双荧光发射现象，表明所合成的d-Au NCs确实是一种新的金簇物种。 有趣的是，作者发现缬氨酸可以特异性增强d-Au NCs在630 nm处的荧光强度而对420 nm的荧光强度无影响（如图1b）。作者解释产生这一现象的原因是因为缬氨酸和Au(I)-GSH单元的相互作用促进Au(I)-GSH单元向Au(0)核之间的配体-金属电荷转移作用，从而增强在630 nm的荧光。而由于11-MUA是一个长链分子，巯基和羧基分布在两个远端，所以11-MUA的羧基与缬氨酸与11-MUA的羧基结合对Au(I)-11-MUA单元向Au(0)核电荷转移作用的影响不大，因而420 nm的荧光变化不大。 图2. (a) d-Au NC添加不同浓度的缬氨酸(0 - 140µM)的荧光光谱图。(插图为UV光照射下含不同浓度缬氨酸的d-Au NCs溶液)(b) d-Au NC添加不同浓度的Cr3+ (0 - 300µM)的荧光光谱图。(插图为UV光照射下含不同浓度Cr3+的d-Au NCs溶液) 此外，作者进一步发现，Cr3+的存在显著增加了d-Au NCs在420 nm处的发射峰，而减少了在630 nm处的发射峰(如图1b)，这与缬氨酸的效应完全不同。作者解释是由于Cr3+具有吸电子能力，Cr3+和表面Au(I)-GSH相互作用可以降低Au(I)-GSH向Au(0)芯的电荷转移效应，从而降低在630 nm处的荧光发射强度。同样地，Cr3+与11-MUA的羧基结合对Au(I)-11-MUA单元向Au(0)核电荷转移影响不大。随后作者通过透射电镜（TEM）表征发现，加入Cr3+后，d-Au NCs发生聚集。因此，作者认为是Cr3+诱导金簇之间交联从而钢化Au(I)-11-MUA，导致420 nm的荧光增强。那么，当样品中缬氨酸和Cr3+同时存在时，是否会因为产生不同的效应而对检测造成干扰？作者最终通过调节溶液pH和加入螯合剂EDTA有效解决了两种目标物之间的相互影响。 作者将d-Au NCs和Hela细胞在细胞培养基共同孵育，荧光图像中的蓝色和红色通道显示出典型的胞质共定位的明亮荧光信号（图2），放大后的图像进一步证实了Au NCs的分布存在于细胞质中，而不是细胞膜或细胞核中。然后，用d-Au NCs处理的Hela细胞进一步与不同浓度的缬氨酸或Cr3+孵育。随着缬氨酸浓度的增加，红色通道的荧光逐渐增强，而蓝色通道的荧光则保持不变。对于Cr3+成像，随着Cr3+浓度的增加，蓝色通道荧光逐渐增加，红色通道荧光逐渐减少。平均荧光强度统计分析显示缬氨酸（I630/I420）和Cr3+（I630/I420）的细胞内成像所获得的平均比率值分别高于各自的对照组。综合所有研究结果表明：采用d-Au NCs进行缬氨酸和Cr3+的细胞内成像具有更高的对比度和准确性。 图3. 不同组合处理的Hela细胞的亮场和荧光图像。 综上所述， 作者简易的合成了d-Au NCs新型纳米探针，并详细研究了d-Au NCs的合成机理（分为两个阶段）：第I阶段为表面配体交换，第II阶段为表面基团优化与重构。d-Au NCs纳米探针具有稳定性高、水溶性好、细胞毒性低、生物相容性好等特点，已成功应用于细胞内缬氨酸和Cr3+的传感与成像，并详细研究了缬氨酸和Cr3+的荧光响应机制。该工作有望在诊断缬氨酸和Cr3+相关疾病方面得到实际应用。此外，该工作深入了解d-Au NCs的形成机制，为通过操纵表面单元结构来合成新的团簇奠定了基础。（文：菜菜的黄） |
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