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作者：追风 在CRISPR-Cas9辅助的受精卵敲入技术(Knockin，KI)中，目前一个很大的挑战是难以获得大DNA片段(千碱基大小)的高效KI，这也是领域内的热点和难点。尽管针对KI技术的各种优化层出不穷，快速、高效地产生具有靶向大片段插入的KI小鼠仍然是小鼠遗传学中的一个主要障碍。 此前，来自加拿大多伦多儿童医院的Janet Rossant团队曾于Nature Biotechnology发文，描述了一种称为二细胞同源重组(2C-HR)-CRISPR的方法，在胚胎处于二细胞阶段将CRISPR试剂导入胚胎能获得高效的KI，它利用了开放的染色质结构和在长G2期可能提高同源重组效率的优势。结合2C-HR-CRISPR和改进的生物素-链霉亲和素方法将修复模板定位到目标位点，研究者获得了比标准方法提高10倍以上(高达95%)的KI效率。 但此研究自2018年6月发表以来，一直没有其他课题组跟进，这种二细胞同源重组(2C-HR)-CRISPR的方法是否真的能获得如此之高的KI效率也是一个疑问。 2020年5月98日，日本理化学研究中心Hiroshi Kiyonari团队在Cell Reports发文， 首次提出Sprint-CRISPR，一种在S期原核注射能提高小鼠胚胎大片段KI效率的方法。 研究者首先利用基于HR的方法优化了在Rosa26位点导入绿色荧光蛋白KI的条件，确定了ctRNP的使用可以显著提高KI效率。在与基于MMEJ和HMEJ的方法的平行比较中，基于HR的方法产生了最有效和最准确的KI。同时使用piezo辅助注射技术来提高存活率，能够研究PN阶段基于HR的KI的合适注射时机。结果发现PN3-PN4/S期的KI效率高于PN5/G2期，在Rosa26位点能获得高达70%的KI效率。 在其他基因位点上也观察到了同样的趋势，导致14个KI等位基因的成功产生，这些等位基因具有不同的供体大小和基因组位置。此外，通过结合这些改进的技术，开发了一种通过将双等位基因KI事件同时注射到母体和父体原核中来实现双等位基因KI的有效方法。 总之，本研究主要关注原核注射的时机，并提出与2018年NBT文章不同的观点：在长G2期注射的KI效率并不如S期注射。当然，研究者也提出不同的注射条件，如注射部位(细胞核与细胞质)、Cas9形式(蛋白与mRNA)和gRNA构型(crRNA-tracrRNA与sgRNA)，是否会影响kb大小的DNA片段KI的最佳注射时机，还有待观察。期待将来更多的研究来进一步解决此争议。 参考文献： 1.https:///10.1016/j.celrep.2020.107653 2..https://www./articles/nbt.4166  版权作品，未经PaperRSS书面授权，严禁转载，违者将被追究法律责任。 PaperRSS，关注生命科学，高校院所科研进展。 |
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