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文章信息： 题目：CRISPR/Cas9‑mediated mutagenesis of Clpsk1 in watermelon to confer resistance to Fusarium oxysporum f.sp. niveum 刊名：Plant Cell Reports 作者：Man Zhang et al. 日期：2 February 2020 单位：Jiangsu Academy of Agricultural Sciences 摘要 1 CRISPR/Cas9 系统已被证明是一种有效的作物基因组编辑工具。先前的研究描述了植物硫素 (PSK) 信号传导可以减弱植物免疫反应。在这项工作中，我们使用 CRISPR/Cas9 系统敲除编码 PSK 前体的 Clpsk1 基因，以增强西瓜对尖孢镰刀菌的抗性。分析了 PSK 和 FON （尖孢镰刀菌）之间的相互作用，发现 Clpsk1 的转录本在 FON 感染后被显着诱导。外源PSK的施加，促进了病原体的生长。然后，选择一个靶向Clpsk1第一个外显子的sgRNA用于构建pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1表达组建。然后通过根癌农杆菌介导的转化方法将该构建体转化西瓜。获得了6株植物突变体，基于Sanger测序鉴定了预期位置的3种突变类型。抗性评估表明，Clpsk1 功能丧失使西瓜幼苗对 FON 感染的抵抗力更强。这些结果表明，CRISPR/Cas9 介导的基因修饰是一种有效的西瓜性状改良方法。 技术路线 2
主要结果 3 3.1 PSK 与 FON 的互做 为了确定 PSK 信号传导是否在西瓜对 FON 的免疫反应中起作用，我们首先测试了接种 FON 的西瓜根中 Clpsk1 基因的丰度。Clpsk1 的表达在接种后12 小时（hpi）被轻微诱导，然后随着时间逐渐上调（图1a）。在与 FON 的共生过程中，Clpsk1 的最大水平发生在 48 hpi。然后我们通过应用外源 PSK 来研究真菌的生长。与对照相比，50 μM PSK 的施用显着促进了真菌的生长（图1b）。
3.2 CRISPR/Cas9 介导的转基因西瓜中 Clpsk1 的诱变 通过农杆菌介导的转化将表达载体pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1引入西瓜。共产生了六个抗潮霉素的株系。这些转基因系使用 cas9 基因进行筛选，它们都产生了 cas9 特异性 480 bp 扩增条带（图 3b）。为了表征 CRISPR/Cas9 诱导的突变，所有阳性系均由 Clpsk1 特异性引物扩增，并直接对含有扩增子的靶标进行测序。Sanger测序结果显示，6株T0转基因植株中有3株（1、2、3系）为纯合突变体，具有双碱基缺失（-CT）；两个（第 4、5 系）分别是具有 2（-CT）和 6碱基（-CTCTT…T）缺失的杂合系；一个（第6系）是具有2-（-CT）和6-碱基（-CTCTT…T）缺失和1-碱基插入（+A）的嵌合植株（图3a，c）。
3.3 突变系对 FON 的敏感性 为了表征枯萎病抗性表型，6个T0突变株系进行自花授粉，T1植株用于敏感性分析。T1后代的测序结果表明，除了现有的突变外，没有观察到其他的突变。具有不同类型突变的T1植株，用FON孢子悬浮液接种。未转化的 西瓜分别用作易感和抗病品种做为对照。21d后测试植物的疾病反应等级。正如预期的那样，虽然与 WT 相比，所有 Clpsk1 突变体植物都表现出抗性表型。其中，4株转基因株系中度抗性，发病率为33～48%，1株表现为抗病性（发生率为68%）。该结果表明敲除Clpsk1基因使西瓜幼苗对FON更具抗性。 总结 4 本研究展示了植物防御病原体感染中 PSK 信号传导的机制，为人们进一步研究 Clpsk1 在西瓜和FON 互做提供了依据。 获取原文 5 原文详见：https://www./h-nd-73.html#_np=107_355的附件。 |
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