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作者：追风（特邀撰稿） CRISPR-Cas系统为微生物提供对感染性核酸的适应性免疫，并被广泛用作基因组编辑工具。这些工具使用RNA引导的Cas蛋白，这些蛋白的大小从约950到1400个氨基酸不等。在AAV介导的CRISPR基因治疗中，由于AAV包装大小约4.7kb的限制，小Cas9蛋白（小于1100）由于体积小而更受欢迎。此外，目前大火的碱基编辑技术（BE）就由于BE原件过大而只能拆成两半（Split-BE）来包装AAV，这极大地降低了BE的体内编辑效率。目前用于基因编辑最小的CjeCas9也有984个aa，对于BE的AAV包装还是过大。因此，寻找更小的Cas核酸酶一直是基因编辑领域的热点。 此前，2018年11月，CRISPR领域大牛加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna团队在Science发文， 首次在未培养的古细菌中发现一类新的Cas核酸酶，Cas14，这是一个非常紧凑的RNA引导核酸酶家族(400到700个aa)。 研究发现Cas14蛋白的尺寸很小，但它能够靶向切割单链DNA(ssDNA)，而不需要PAM序列。此外，Cas14的靶标识别还能触发了ssDNA分子的非特异性切割，能够用于高精度的核酸检测 (Cas14-DETECTR)。Cas14有24个变体，分为三个亚型：Cas14a-c，所有Cas14蛋白都包含一个保守的RuvC核酸酶结构域。此外，Cas14仅存在于古细菌中，而不存在于细菌中。因此，该基因可能比Cas9和Cas12更原始。 遗憾的是，尽管Cas14有良好的ssDNA识别和切割活性，可以用于ssDNA病毒等的核酸检测，但却没有双链DNA(dsDNA)切割活性，理论上不能用于基因编辑。 2020年4月4日，维尔纽斯大学教授、立陶宛科学院院士Virginijus Siksnys在NAR发文，鉴定了10个特别紧密的(422-603个aa) Cas12f核酸酶（即以前的Cas14，最新分类后称为Cas12f），发现它们能以PAM依赖的方式识别和切割dsDNA。 这次发现的10个Cas12f被归类为2型V-F，起源于先前发现的Cas14家族和在细菌中发现的远亲的V-U3型Cas蛋白。利用生化方法，研究者证明了富含5’T或C的PAM序列可触发dsDNA靶标切割。基于这一发现，又评估了Cas12f是否能够保护大肠杆菌中的dsDNA免受入侵，但发现不是所有的都可以。值得一提的是，在本研究之前的bioRxiv版本中，还尝试过在HEK293T细胞中进行内源基因组位点的编辑，发现能检测到indels的结果但效率极低。有意思的是在NAR正式online的版本中删去了此结果，因此在细胞中是否真的有效还有待进一步研究。 总之，本研究首次发现小型的Cas12f核酸酶可以能以PAM依赖的方式识别和切割dsDNA，并有可能作为可编程核酸酶用于基因组编辑。 几点思考： 1.本研究虽然首次提出Cas12f也能以PAM依赖的方式靶向并切割dsDNA，但没有与SpCas9、Cas12a等比较切割效率。目前来看似乎效率极低，直接用于基因编辑恐怕有一定难度。 2.Cas14/Cas12f的优势主要在足够小，Cas12f-CBE都能足够包装AAV，因此可以大胆尝试下Cas12f-BE有没有效率。但考虑到Cas12f恐怕不像Cas9有足够高的解旋活性，因此会影响作用于ssDNA的脱氨酶的效率。目前加额外的解旋酶也不是很可行的方法，可以尝试用高活性的A3A，eCDA1，eAID和ABE8e等来提高效率。 参考文献： 1.https://science./content/362/6416/839?rss=1 2.https:///10.1093/nar/gkaa208 
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