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作者：追风 CRISPR-Cas系统为微生物提供对感染性核酸的适应性免疫，并被广泛用作基因组编辑工具。但有矛必有盾，在与细菌的军备竞赛中，噬菌体也进化出了CRISPR-Cas蛋白抑制剂，称为Anti-CRISPR(Acr)。 2020年3月16日，Acr领域大牛、加利福尼亚大学Joseph Bondy-Denomy在Nature Methods撰写了“Anti-CRISPR蛋白应用：CRISPR-Cas技术的天然刹车”的综述。这是目前比较新和比较全的Acr领域综述，笔者最近对此也较感兴趣，因此介绍其中主要内容，以飨读者。 共同进化的军备竞赛是创新的沃土。移动遗传元件(MGEs)对原核宿主施加的强大选择压力证明了这一点，产生了强大的技术，如限制性内切酶和CRISPR-Cas核酸酶。CRISPR-Cas系统为原核生物提供了对病原体的适应性免疫。这些多蛋白(第1类)或单蛋白(第2类)核酸复合物使用一个gRNA或crRNA来靶向侵入性核酸。尽管不断增长的CRISPR-Cas工具箱提供了革命性的优势，这些技术的有效性和安全性仍然存在一些挑战。例如，在体内或体外编辑细胞中的Cas核酸酶活性可能导致脱靶效应、意想不到的靶点效应、细胞毒性和免疫原性，所有这些都需要解决，以开发安全的基因组编辑应用。 Acr蛋白是由不同MGEs(如质粒和噬菌体)编码的天然CRISPR-Cas拮抗剂的集合体，在不同的阶段抑制CRISPR-Cas的免疫功能。迄今为止,45种非同源的Acr蛋白(24种1类, 21种2类)被发现,这些Acr具有不同的机制和结构,没有明显的序列相似性。不同的Acr基因通常可以发现相邻,这使得他们被发现。许多Acr蛋白能够直接干扰CRISPR-Cas在异种宿主中的功能，这为源自CRISPR-Cas的技术提供了基因可编码的、翻译后的调节。 图1：CRISPR-Cas免疫机制及Acr蛋白抑制机制 Acr蛋白通过直接与Cas蛋白相互作用来抑制CRISPR-Cas的功能，以防止目标DNA结合、切割、crRNA装载或效应复合物的形成。例如，一些抑制I型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白与crRNA引导的级联复合物相互作用，阻止DNA结合，而另一些则阻止Cas3核酸酶的招募。已阐明的II型Acr蛋白的机制也给出了类似的结论，其中与Cas9的直接相互作用通过空间闭塞限制了DNA结合，或者阻止了HNH核酸酶结构域的激活-允许DNA结合，但阻止了目标切割。Cas12a抑制剂AcrVA1通过酶机制工作，当与Cas12a结合时切割gRNA。 Acr蛋白是以它们被发现的顺序和抑制的系统来命名的。例如，广泛使用的AcrIIA4蛋白是发现的第四种II-A型Acr蛋白。几种Acr蛋白已经被证明成功地调节了不同细胞类型的基因编辑活动，最著名的是两种SpyCas9抑制剂(AcrIIA2和AcrIIA4)20和两种NmeCas9抑制剂(AcrIIC1和AcrIIC3)。 表1：目前Acr蛋白分类及其抑制机制的总结 一、原核生物中的Acr蛋白应用： CRISPR-Cas是许多原核生物应用的有力工具。基于Cas9的编辑已经在许多细菌中使用，从模式生物，如大肠杆菌，到工业上相关的属于梭状芽孢杆菌、乳杆菌或链霉菌属的物种。内源性CRISPR-Cas系统也可用于编辑应用，因为大约40%的测序可培养细菌和87%的古菌携带某种类型的CRISPR-Cas系统。在这些应用中，Acr蛋白有双重用途：(I) 识别内源性CRISPR-Cas抑制猖獗的菌株意味着编辑将不会有效；(II)增强时间控制，这可以使细菌和噬菌体基因组编辑成为可能，而这在以前是不可能的。 在尝试使用CRISPR-Cas系统编辑或杀死细菌时，内源的Acr可能是一个常见的障碍。如果一个菌株对一个内源性CRISPR系统编码Acr基因，那么使用外源性系统进行编辑可能是一个更有效的方法。在天然具有Cas9的细菌中，如单核增生L.，由于存在抑制Acr基因，通常使用的SpyCas9蛋白可能不是一个可行的方法。需要继续识别Acr蛋白及其抑制或阻断其活性的机制，以广泛地在细菌中实现基于CRISPR的编辑。 Acr蛋白也可以直接用于增强微生物的基因编辑策略。例如，许多微生物的低转化效率限制了在表达以基因组为目标的crRNA后恢复转化子的能力。Acr蛋白的受控表达可能减轻基因组靶向的毒性作用，从而实现稳定的转化(图2b)。此外，利用Acr基因作为选择标记，赋予对本地CRISPR-Cas系统的抗性，可以为病毒工程提供一条新的途径，而这方面的可选择标记很少(图2c)。Acr蛋白在抗菌方面也很有用。由于CRISPR-Cas系统被认为可以调节细菌的毒力,Acr蛋白可以破坏这些致病菌依赖于CRISPR的毒力机制(图2e)。最后，Acr基因也可以用于增强噬菌体治疗方法，因为它们可以扩大噬菌体宿主的范围(图2f)。随着耐抗生素细菌在全球范围内的繁殖，噬菌体疗法重新成为对抗细菌感染的一种替代方法。 图2：Acr基因在原核生物中的应用 二、真核生物中的Acr应用及Acr的调控： CRISPR-Cas系统已经在许多真核系统中异源表达。Cas9和Cas12a主要由于它们在许多物种中易于编程和表达而被使用。然而，Cas核酸酶已被证明会导致不同程度的脱靶编辑，这可以用“关闭开关”来补救。延迟引入Acr蛋白提供了一种灵活和可调的机制，在使用野生型Cas酶的同时限制脱靶编辑。大多数Acr蛋白相对较小(~50-200个aa)，这也使它们在AAV的原位传递过程中具有很好的应用前景。 CRISPR-Cas系统越来越多地被利用来改变基因表达，而不需要切割。dCas9或dCas12a已与各种功能域融合，包括转录激活因子、抑制因子和表观遗传修饰因子(图3)。由于大多数Acr蛋白阻止Cas蛋白与DNA结合，它们已被用来在空间和时间上调节这些过程，并证实它们是由Cas依赖的活性引起的。 为了实现对CRISPR-Cas活性更快速、动态的控制，已经发现或开发了几种调节Acr表达和活性的方法，包括(I)转录的、(II)转录后的、(III)光调控的和(IV)基于配体的策略(图3)。 图3：Acr蛋白的应用和调控 三、利用Acr控制基因驱动： 基于CRISPR-Cas的技术的出现通过基因驱动加速了生态工程的潜力，基因驱动通过超孟德尔机制在人群中传播工程性状(图4a,b)。基因驱动有可能以各种方式极大地造福人类健康，包括减少疟疾或登革病等虫媒疾病，消灭入侵物种，提高农业的可持续性。然而，基因驱动也面临着警告，因为它们可能会产生不可预见的后果，或者被用于邪恶的目的，从而导致大规模的破坏。由于这些原因，在基因驱动技术可以在野外使用之前，需要多种可靠的安全措施。 Acr蛋白目前是抑制或调节驱动强度的最直接和最广泛的作用(即独立于sgRNA序列)方法，可以与基因驱动一起部署或在基因驱动之后部署(图4c)。最近研究表明，AcrIIA2和AcrIIA4都能不同程度地抑制基因驱动，其中AcrIIA4在酵母模型系统中的抑制率99.9%。因此，Acr蛋白提供了一种微调控制基因驱动的方法，这可能使这项前景看好的技术得以安全部署。 图4：利用Acr控制基因驱动 四、Acr的优势： 虽然已经开发了许多调节CRISPR-Cas活性的策略，但Acr蛋白有几个特征使它们非常适合某些应用： 1. Genetically encodable遗传编码。Acr基因可以被编码并通过载体运送到体内的细胞中，或者被用来在原位停止基因驱动。由于它们独立于CRISPR-Cas系统，因此可以根据需要部署它们来关闭或维护所需的Cas活动动态范围。这可用于持续保护细胞不受编辑，微调Cas活动量和持续时间，并限制诱导型CRISPR-Cas系统中不需要的背景水平。 2. Broad spectrum广谱。许多Acr蛋白，如AcrIIA5，AcrIIC1和AcrVA1，已被发现抑制其靶标的多个同源基因。这种广谱活性可以用来调节CRISPR-Cas系统的多种天然和工程变体，而不需要重新设计每个Cas蛋白。 3.Diverse in strength and mechanism在作用强度和机制上的多样性。已经发现多个Acr蛋白以同一核酸酶为靶标，但它们的大小、抑制强度和作用机制存在很大差异。相应地，可以根据分析的需要选择和优化(或弱化)Acr蛋白。 4.Easy to use简单易用。使用标准的分子生物学工具箱，Acr蛋白可以很容易地集成到各种体内和体外系统中，而不需要昂贵的配体、设备或蛋白质工程。 五、Acr的限制： 1. Additional component附加组件。Acr蛋白的外部调节为系统引入了一个额外的成分。使用遗传编码的Acr序列可能需要额外的载体或增加载体大小。 2.Slow reversibility缓慢的可逆性。虽然CRISPR-Cas的抑制程度可以用不同效力的Acr蛋白来滴定，但如果没有额外的工程，单一的抑制事件是不容易逆转的。Acr蛋白对化学计量的CRISPR-Cas的抑制可以通过增加Cas蛋白的量或降低Acr的表达来克服，但这可能比其他调节方法，如小分子或光遗传学直接作用于Cas酶的速度要慢。 3. Potential toxicity or immunogenicity潜在的毒性或免疫原性。两种Acr蛋白已经在小鼠体内表达，但没有造成明显的组织损伤，但目前尚不清楚它们是否与其他宿主蛋白相互作用或引发宿主反应。一些Acr蛋白的表达已显示出毒性。在体内还必须考虑其他参数，包括Acr蛋白的稳定性、最佳表达水平和脱靶相互作用的可能性。 结论： 展望未来，预计Acr蛋白的发现可以与新CRISPR-Cas系统的发现和开发相匹配。编码Acr基因的MGEs在几种CRISPR-Cas类型和亚型中尚未确定，最明显的是类型VI系统。这些系统的Acr基因的发现将为Cas蛋白提供调控工具，并可能揭示这些系统尚未发现的机制新颖性。最后，Acr蛋白直接干扰CRISPR免疫的其他阶段，如crRNA加工和间隔区获取，而不是靶向，尚未有报道。 还必须做更多的工作来确定Acr蛋白在体内是否安全有效地关闭开关。虽然Acr蛋白已被证明能抑制Cas9在小鼠中的编辑，但目前尚不清楚它们是否曾诱导毒性或引发宿主反应，这必须确定才能在动物身上安全实施。Acr蛋白在防止动物的脱靶编辑或停止基因驱动方面的有效性也有待证实。这里描述的CRISPR-Cas系统和它们的对手的应用代表了这些技术的早期阶段，很可能会有很多创新。 原文链接： https:///10.1038/s41592-020-0771-6  版权作品，未经PaperRSS书面授权，严禁转载，违者将被追究法律责任。 PaperRSS，关注生命科学，高校院所科研进展。 |
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