（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）

说明：以下实验方法使用了millipore公司的ChromatinImmunoprecipitation (ChIP) Assay Kit （Catalog #17-295）。

第一天

（一）细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出三个10cm平皿均匀种下细胞，在转录的最佳条件下培养，三个分别用来计数、对照、实验，待细胞数目达到约1×10⁶时，直接加入270 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有10 ml）；

2、37℃孵育10min；

3、吸尽培养基，用冰冷的PBS（临用之前加入蛋白酶抑制剂PMSF使终浓度达到1mM）清洗细胞2次；

4、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中，预冷后2000rpm 4℃离心 5min收集细胞；同时将SDS LysisBuffer从冰箱中取出平衡至室温；

5、倒去上清，加入200 μl SDS LysisBuffer（对应细胞数为1×10⁶，可以按照实际细胞数进行倍增）裂解细胞，并保证加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上孵育10 min；

6、超声破碎：VCX750，25%功率，4-5S冲击，9S间隙。共14次，使DNA断裂成200-1000bp的片段，（第一次试验前可以加入8 μl 5 M NaCl， 65℃水浴4 h解交链，然后提取DNA进行电泳检测，以获得最适的超声破碎条件）。

（二）除杂及抗体哺育。

7、超声破碎结束后，13000 rpm 4℃离心10 min，转移上清至2 ml离心管中，取做实验，其余可以保存于-80℃冰箱中；

8、300 μl中，100 μl加抗体作为实验组；100 μl不加抗体做为对照组；100 μl加入4 μl 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理4 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果；

9、在100 μl的离心上清液中，加入900 μl ChIP DilutionBuffer和20 μl的50×PIC，再各加入60 μl ProteinA Agarose。4℃颠转混匀1h,减少非特异性蛋白背景；

10、1h后，在4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min；

11、取上清。各留取20 μl作为input。一管中加入1 μl抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

（三）检验超声破碎的效果

100 μl超声破碎后产物，加入4 μl5MNaCl，65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天  免疫复合物的沉淀及清洗

12、孵育过夜后，每管中加入60 μl ProteinA Agarose，4℃颠转1 h，收集抗体和组蛋白的结合物；

13、4℃静置10min后，700 rpm 4℃离心1min。除去上清；

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物，清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700rpm 4℃离心1min，除去上清，洗涤溶液依次为：

a.low salt wash buffer-onewash

b.highsalt wash buffer-onewash

c.LiCl wash buffer-onewash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后，（所得样品可以加入25 μl 1×蛋白上样缓冲液进行western检测，也可以按照以下步骤进行核酸检测），开始洗脱。洗脱液的配方：100 μl 10%SDS，100 μl 1 M NaHCO₃，800 μl ddH₂O，共1 ml；

16、每管加入250 μl洗脱液，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次，最终的洗脱液为每管500 μl；

17、解交联：每管中加入20 μl 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），混匀，65℃解交联4 h，（在该步，可以将混合物置于-20℃中过夜，次日继续试验）。

第三天   DNA样品的回收与检测

18、解交联结束后，每管加入1 μl RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。

19、每管加入10 μl 0.5M EDTA，20 μl 1M Tris.HCl（pH 6.5），2 μl 10mg/ml蛋白酶K，45℃孵育1 h；

20、DNA片段的回收——试剂盒，最终的样品溶于100 μl ddH₂O；

21、进行PCR检测。