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之前我们为大家讲解了《MTT实验测定细胞增殖详细操作手册『点击阅读』》，今天我们就为大家讲解一下CCK-8检测细胞活性的方法。 Cell Counting Kit-8，简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。 WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系（图2）。 图1. WST-8检测原理图 (EC=electron coupling reagent，即电子耦合试剂) 图2. CCK-8检测细胞活性原理图 WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。 细胞活性检测 1、在96孔板中接种细胞悬液（100 μl/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃, 5% CO2）。 2、向每孔加入10 μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 4、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 注：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 细胞增殖-毒性检测 1、在96孔板中配置100 μl 的细胞悬液（2000-5000 cells）。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。 2、向培养板加入10 μl 不同浓度的待测物质。 3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。 4、向每孔加入10 μl CCK-8溶液（不要让孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 注：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 Cell Number Determination 1. Inoculate cell suspension (100 μl/well) in a 96-well plate. Pre-incubate the plate in a humidified incubator (e.g., at 37°C, 5% CO2). 2. Add 10 μl of the CCK-8 solution to each well of the plate. Note：Be careful not to introduce bubbles to the wells, since they interfere with the O.D. reading. 3. Incubate the plate for 1 - 4 hours in the incubator. 4. Measure the absorbance at 450 nm using a microplate reader. Note：To measure the absorbance later, add 10 μl of 1% w/v SDS or 0.1 M HCl to each well, cover the plate and store it with protection from light at room temperature. No absorbance change should be observed for 24 hours. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay 1. Dispense 100 μl of cell suspension (5000 cells/well) in a 96-well plate. Pre-incubate the plate for 24 hours in a humidified incubator (e.g., at 37°C, 5% CO2). 2. Add 10 μl of various concentrations of substances to be tested to the plate. 3. Incubate the plate for an appropriate length of time (e.g., 6, 12, 24 or 48 hours) in the incubator. 4. Add 10 μl of CCK-8 solution to each well of the plate. 5. Incubate the plate for 1 - 4 hours in the incubator. 6. Measure the absorbance at 450 nm using a microplate reader. 上海市元象医疗器械有限公司 上海市元象医疗器械有限公司致力于生命科学研究领域内的产品推广与服务。 主营产品有细胞凋亡与增殖检测试剂盒、ELISA试剂盒、细胞培养类试剂、各类生化试剂、科研抗体、生物耗材等。公司现为凯基﹑Sigma﹑Immunoway、Corning 、Axygen等国内外知名公司在沪一级授权代理商。 |
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