驾驭基因表达调控（6）关于 miRNA 海绵（miRNA sponge）你是否有很多问号？

真核生物中的 RNAi 机制对基因表达调控有重要影响，在此之上发展出的 RNAi 技术成为基因表达调控有力工具。然而如果我们要研究 RNAi 本身，例如 miRNA，该怎么办？

miRNA Sponge 诞生背景

1976 年，Sanger 首次在类病毒中发现了单链共价闭合环状的 RNA 分子。随后的研究逐步发现，多种哺乳动物中存在成千上万 circRNA，并且这些 circRNA 能够有效调节 miRNA 活性。

miRNA Sponge 是目前最受学界认可的 circRNA 功能模型。该模型由 Nikolaus Rajewsky 提出。随后的研究定义了 CDR1as 和 Sry 两个著名的 circRNA 分子。证明自然界广泛存在 miRNA Sponge 可以作为 miRNA 长效抑制分子。

miRNA Sponge 最早在 2007 年由麻省理工大学的 Phillip Sharp 及其同事开发并命名，用于长效抑制 miRNA。

在哺乳动物中，miRNA 调节了约 30% 编码基因，由于研究工具和作用机制研究不够深入，大量 miRNA 靶点和功能仍不清楚。

功能缺失实验一直是基因功能研究的重要模型。但 miRNA 功能缺失很难开展，有团队开发化学修饰的寡核苷酸来抑制 miRNA，但这种作用只能在短期抑制 miRNA，难以构建稳定 miRNA 抑制细胞系。

基因定向敲除 miRNA 的效果也不佳。同一种基因的表达抑制往往涉及不同基因组位置、多种具有相似 seed 序列 miRNA 的共同作用。敲除单一 miRNA 位点往往不能达到预想的基因调节效果。

为此，麻省理工大学研究人员开发了 miRNA sponge 技术，用于长效抑制多种具有相同功能的 miRNA。

该技术将串联重复（6x或8x）miRNA 结合域克隆至由 CMV 启动子调控的载体上转染宿主后，miRNA sponge 以 mRNA 的形式转录至胞质中，诱导胞质中具有相似结合域的 miRNA 结合，起到一种类似海绵的 miRNA 吸收作用，与 RISC 竞争结合胞质中游离的具有特定 RNA 结合域的 miRNA。同时达到抑制一类 RNA 结合域的 miRNA 和长期抑制效果。

经测试这项技术的 miRNA 沉默效率和人工合成修饰的反义寡核酸相当，是很有竞争力的 miRNA 沉默工具。

 

 

相关实践应用

我们自己如何设计构建 miRNA sponge 呢？

非常简单。

首先我们可以在 miRBase 上获取特定 miRNA 的成熟序列，选择其 5’ 开始 1-22 个碱基序列的反向互补，保留 2-8 bp 的 seed 区，将 9-12 bp 负责 RISC 切割位点的区域突变。使 miRNA 在与 miRNA sponge 尽可能特异性结合的同时，抑制 RISC 对这种双链结构的剪切，达到长期抑制 miRNA 水平的目的。

随后，将突变后的序列重复 6 次或 8 次后，克隆普通的过表达载体，如果需要稳定表达，则可选择构建到病毒载体上。

载体构建并转染宿主成功后，我们可以选择商业化的 miRNA 检测试剂盒，检测 miRNA 沉默效果。检测原理和 mRNA 检测类似，样本都是经过聚合酶加尾并反转录为 DNA 后，再设计特定引物 qRT-PCR 检测定量。

值得注意的是 PCR 方法需要以 U6 为对照。U6 是一类 snRNA，由 RNA 聚合酶 III 转录，主要形成小核糖核蛋白颗粒，定位于细胞核内，表达稳定。由于长度和前体 miRNA 接近，200 bp 左右，在组织中稳定高表达，本身也不涉及 miRNA 调节途径，是优良的内参选择。

但有时我们也会遇到 PCR 检测 miRNA 含量没有明显差异的情况。先别惊慌，由于 miRNA sponge 本质是竞争结合而非完全降解，宿主中 miRNA 存在被 PCR 检测的风险。这个时候，我们可以检测 miRNA 靶基因，如果靶基因表达明显上调，也能说明 miRNA 沉默成功。

 

下期预告

非编码基因由于只能转录不能翻译成蛋白质的 RNA，长期被认为是垃圾基因，没有生物功能。但人类基因组仅有约 2% 序列为编码基因，武断认为剩下 98% 都没有作用并不符合生物进化逻辑。

越来越多的研究开始关注诸如 miRNA、lncRNA 等非编码基因产物。功能缺失实验是常见的基因功能研究方法，相关实验开展依赖于众多精巧的基因沉默工具。像咱们之前讨论的转录调控、核酸酶、shRNA 等都在此列。

细心的小伙伴一定发现了，我们没有讨论 lncRNA 的沉默调控。这一方面源于 lncRNA 定位飘忽不定，和内核外都能检测到，作用范围有限的沉默工具，如 RNAi，效果不佳。另一方面 lncRNA 本身的表达调控尚不明确，转录抑制的方法也困难重重。

所幸近些年兴起的基因编辑技术为基因缺失功能研究提供了强大工具，同时具有几乎完全敲除编码和非编码序列的能力。之后几期，小编将为大家详细介绍这种 ‘黑科技’，敬请期待。